Western-Blot-原理和操作方法（全）

FFFF. 纯化过的目的带包括其上下都出现了色带，而且对照菌也出现了条带，会是什么原因? 解答：一抗有问题，效价太低，且未纯化；表达量太低；提蛋白时可能出

了问题。

GGGG. 做Western Blot的检测的时候，用DAB显色还能看出条带，但是换成ECL的时候什么样结果都没有。我用的NOVA公司的发光底物，胶片是普通的X片，定影液和显影液都是别人留下来的，不知道是什么原因？

解答：一般的说，Ecl比DAB更灵敏，但是DAB是HRP最敏感的底物，所以有几种可能： ECL底物失活了，你可以检测一下；敏感度正好不到ECl底物的范围。DAB能显色可不能催化ECL底物；显影液没用了。

HHHH. 怎样分析结果，需要什么软件?

解答：如果你做定量或办定量，至少要用到一个光密度扫描分析软件，如果不是，直接分析就可以了。

IIII. 积层胶、分离胶一般多少左右合适？ 解答：一般电泳是积层胶60-80v，分离胶100v。

JJJJ. 采用生物素标记的二抗－SABC-DAB检测系统做western，非特异性的条带和背景高？总蛋白考染的时候发现接近积层胶的条带比较清楚，条带也很窄，可是越靠下面的条带越来越宽，有的跑得都连在一起了，这是什么原因，如何解决？sds－page的时候恒压和恒流哪个好？

解答：非特异性的条带和背景高：可能性太多了，一抗，二抗，封闭的原因都可能。 总蛋白考染的时候发现接近积层胶的条带比较清楚，条带也很窄，可是越靠下面的条带越来越宽，有的跑得都连在一起了，这是什么原因，如何解决？正常的，另外，是否是你的积层胶有问题。sds－page的时候，恒压和恒流都可以用。

KKKK. 血清样品进行Western Blot 分析，目的蛋白21kD，结果显色出来后，目的条带很淡，而白蛋白和IgG条带很浓？

解答：可能是因为白蛋白为67kD和目的蛋白相差教大，且他的浓度较低，你可以以底物二氨基联苯胺和0．01％过氧化氢溶液显色的时间延长为30分钟，再用去离子水漂洗以终止

反应;也可能是抗体的特异性不好。把封闭的时间延长，同时提高封闭液的浓度，可以减少以下背景噪音。同时洗的时候要彻底，而目的条带弱，说明浓度不足，如果不考虑后续功能的话，你可以过G-50（细）柱子，纯化你的靶蛋白，接着真空冷冻浓缩，可以得到很漂亮的结果。

LLLL. Western转膜已经成功了，但是Marker泳道未见蛋白条带（正常应该有6条），其余各泳道均有清晰的蛋白条带，经考马斯亮蓝染胶，结果相同。经5％的脱脂牛奶封闭1小时45分钟后，进行一抗孵育（1：200，建议起始浓度）过夜，二抗孵育5个半小时（1：2000），均在室温下，DAB显色，虽出现蛋白条带，但较弱，且出现非特异性条带。请问：1、Marker是MBI公司的，可分离14-116KD的蛋白，买了大概有一年的时间，是否有问题？2、一抗（为多克隆抗体）、二抗的浓度及孵育的时间是否合适？ 3、封闭的时间是否太短？

解答：1. marker 有可能被降解了， 也有可能是它标称的上样量太少，不够，我做过一个标称每次5ul可我上了20ul才行的。