一些抗氧化酶活性的测定

一、SOD、POD、MDA和蛋白质测定

（1）酶液的提取（可用于测定SOD、POD、MDA和蛋白质）

取0.5g样品加5ml 0.05M（pH7.8）的磷酸缓冲液冰浴研磨（2ml磨样，3ml冲洗）后转入10ml离心管中，4℃，10000rpm离心20min，上清液即为酶液 （2）SOD、POD、MDA和蛋白质的测定 1 SOD活性测定（NBT法）

试剂药品：0.05M 磷酸缓冲液（pH7.8）；130mM 甲硫氨酸（Met）；750μM氮蓝四唑（NBT）；100μM EDTA-2Na；20μM 核黄素

0.25ml蒸馏水 0.3ml 20μM 核黄素

① 3ml反应体系

1.5ml 0.05M（pH7.8）PBS 0.3ml 130mM Met 0.3ml 750μM NBT 0.3ml 100μM EDTA-2Na

50μL酶液（光对照和暗对照以磷酸缓冲液代替

酶液，酶液用量可自行调节，以吸光值在0.1-0.9间即可）

② 将1支暗对照管置暗处，其余样品日光下（4000lx）反应20min（时间可自行调节，反应体系颜色变化即可）。以暗对昭作空白调零，测定光对照及样品560nm处吸光值。 ③ 计算SOD活性（U/g）=（（Ack-AE）·VT·D）/（0.5·Ack·W·VR） （SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位） Ack：光对照管吸光度 AE ：样品管吸光度 VT：酶提取液总体积（ml） VR：测定时酶液用量（ml） W：样品鲜重（g） D：稀释倍数

2 POD活性测定（愈创木酚法）

试剂药品：0.05M 磷酸缓冲液（pH5.5）；0.2%愈创木酚溶液；0.3% H2O2

① 3ml反应体系

50μL 酶液（酶液用量可自行调节，

以吸光值在0.1-0.9间即可） 0.95ml 0.2%愈创木酚溶液 1.0ml 0.3% H2O2 1.0ml PBS（pH5.5）

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最后加入H2O2或愈创木酚启动反应，可使反应体系混合更均匀

② 以PBS pH5.5为对照调零，记录470nm处吸光值（以每1min增加0.01定义为1个酶活性单位）

③ POD活性（U/（g·min））=（ΔA470·VT·D）/（0.01·W·VR·t）

ΔA470：反应时间内吸光度的变化 VT：总的酶液提取液体积（ml） D：稀释倍数 VR：测定时的酶液体积（ml） W：样品鲜重（g） t：反应时间（min） 3 MDA含量测定（TBA法）

试剂药品：0.6% TBA

① 反应体系：1ml提取液+2ml 0.6% TBA，沸水浴15min，冷却离心，取上清在600,532,450nm下测定吸光值 ② MDA含量计算：

反应混合液中MDA浓度C（μmol/L）=（6.45·（A532-A600））-（0.56·A450） 提取液中MDA浓度（μmol/ml）=（CMDA·反应液体积ml）（测定时提取液用量/ml·1000） 样品中MDA含量（μmol·g-1·Fw）=（提取液中MDA浓度·提取液总量ml）/植物组织鲜重g

4 蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G-250法）

试剂药品：考马斯亮蓝

① 标准曲线制作：参照《植物生理生化试验原理和技术》（王学奎版）191页

② 提取液在室温下放置0.5-1h以充分提取，5ml考马斯亮蓝+100μL提取液（用量可调节），混匀，反应2-5min后，在595nm下比色

蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合反应十分迅速，在2min左右反应达到平衡，其颜色可在1h内保持稳定，且在5-20min内颜色的稳定性最好

③ 样品中蛋白质含量（mg/g鲜质量）=（X·VT·N）/（W·VS·1000） X：根据样品的吸光度所查得的标准曲线值（蛋白质质量μg） VT：提取液总体积ml W：样品鲜质量g VS：测定时加样量ml N：稀释倍数

二、叶绿素含量的测定

试剂药品：95% 乙醇

① 取叶片0.1-0.2g，剪成小块放入刻度试管，加95% 乙醇，于暗处放置12h，待叶片绿色褪尽，即可在665、649nm波长下测定吸光值 ② 叶绿素含量计算：

Ca=13.95·A665-6.88·A649

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Cb=24.96·A649-7.32·A665

叶绿素含量（mg/g）=（C·V·N）/（W·1000） C：叶绿素a+b含量（mg/L） V：提取液体积ml N：稀释倍数 W：样品鲜质量或干质量g

三、GSH、AsA含量测定 （1）测定液的提取

取一定部位的植物叶片(视需要而定，去叶脉)0.5g剪碎加入5mL 5% 三氯乙酸(TCA)溶液，研磨， 15000r/min离心10min，上清液定容至5mL。 （2）GSH含量的测定

试剂药品：5%三氯乙酸（TCA）溶液；150mM NaH2PO4（pH7.7）溶液；100mM 磷酸缓冲液（pH6.8）；DTNB试剂（75.3mg DNTB溶于30ml 100mM pH6.8 PBS中）

① GSH标准曲线的制作：配置浓度分别为0mM、0.02mM、0.04mM、0.06mM、0.08mM、0.10mM、0.12 mM的标准GSH溶液，吸取上述标准液各0.25ml，分别加入150mM 的NaH2PO4（pH7.7）2.60ml，混合均匀后，往各管中加入DNTB试剂0.18ml，摇匀后，30℃保温反应5min，测A412（以PBS代替DNTB试剂作空白对照）。将测定结果以GSH浓度为横坐标，光密度值为纵坐标制作标准曲线。

② GSH含量的测定：分别取上述样品提取液0.25ml，各加入150mM NaH2PO（2.6ml、4pH7.7）DNTB试剂0.18ml，以加磷酸缓冲液代替DNTB试剂作空白。摇匀后，于30℃保温反应5min，测定412nm波长下的光吸收值。根据标准曲线计算样品的GSH含量（GSH含量用μg/gFW表示）。

（3）AsA含量的测定

试剂药品：5% 三氯乙酸（TCA）溶液；150mM NaH2PO4（pH7.4）溶液；10% 三氯乙酸（TCA）溶液；44% H3PO4；4% 2,2-二联吡啶；3% FeCl3

① 标准曲线的制作：称取17.613mg的AsA，溶解并定容至100ml，得到1mM的标准母液，利用该标准母液分别配置浓度分别为0mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM的AsA溶液。吸取上述各标准液200μL于编好号的对应的不同试管中，分别往各管中加入150mM NaH2PO4 200μL，H2O 200μL，混合均匀，超过30s后再分别往各试管中加入10% TCA溶液400μL、44% H3PO4 400μL，4% 2,2-二联吡啶400μL，3% FeCl3 200μL，混匀后在37℃水浴中保温60min，然后测525nm处的OD值，将测定结果以AsA浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标制作标准曲线。

② 吸取上述制备好的样品上清液0.2ml，分别加入150mM的NaH2PO4（pH7.4）0.2ml、H2O 0.2ml，混合均匀，至少30s后，再依次分别往各管中加入10% TCA 0.4ml，44% H3PO4 0.4ml，4% 2,2-二联吡啶0.4ml和3% FeCl3 0.2ml，混合后在37℃水浴中保温60min，然后测525nm处的吸光值。根据标准曲线计算样品中AsA的含量（AsA含量用μg/gFW表示）。

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四、抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性的测定

试剂药品：0.05M PBS（pH7.8，7.0）；0.5mM AsA；0.1mM EDTA；0.1mM H2O2 ① APX酶液的制备：称取0.5g材料剪碎，5ml缓冲液冰浴研磨，4℃，10000×g离心20min

② 活性测定：在3个比色皿中各加入20μL提取液，再加入3ml反应液，1号比色皿中不加AsA和H2O2作为参照，2号比色皿中不加H2O2作为控制参照，3号比色皿中加入0.1mM H2O2启动反应，每10s连续记录室温下290nm吸光值的变化X。以室温下每一分钟氧化1μmol AsA的酶量作为一个酶活性单位（U）。

③ 计算活性U=（X·VT·1000·60·1000）/（W·2.8·VR·10）

X：OD值的变化 VT：酶提取液总体积（ml） 1000：将ml转换成μL 60：将1min转换成60s 1000：将mM转换成μmol W：鲜叶质量g 2.8：吸光系数mM/L cm

VR：测定时酶液用量（ml） 10：每10s记录吸光值的变化

部分常用试剂配制： 1 磷酸缓冲液（PBS）：

母液：A液 Na2HPO4·12H2O 71.64g+蒸馏水溶解，定容至1000ml B液 NaH2PO4·2H2O 31.2g+蒸馏水溶解，定容至1000ml

2 测SOD用：

130mM Met（100ml）：称1.9399g Met + pH 7.8 PBS定容至100ml 避光→750μM NBT（100ml）：称0.06133g NBT + pH 7.8 PBS定容至100ml 100μM EDTA-2Na（100ml）：称0。003721g EDTA-2Na + pH 7.8 PBS定容至100ml 避光→20μM核黄素（1000ml）：称0.00753g 核黄素 + H2O定容至1000ml 3 测POD用：

0.3% H2O2（250ml）：吸2.5ml 30% H2O2 + pH 5.5 PBS 定容至250ml 0.2% 愈创木酚（250ml）：吸0.5ml 愈创木酚 + pH 5.5 PBS 定容至250ml 4 测MDA用：

5% TCA（100ml）：称5g TCA + H2O定容至100ml 10% TCA（100ml）：称10g TCA + H2O定容至100ml

0.05M （1000ml） pH 5.5 7.0 7.8 A液ml 10.75 152.5 228.75 B液ml 239.25 97.5 21.25 加H2O定容至1000ml

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10% NaOH（10ml）：称1g NaOH +10ml H2O溶解

避光→0.6% TBA（100ml）：0.6g TBA + 10ml 10% NaOH溶解 + 40-50ml 10% TCA将溶液调成弱酸性 + H2O定容至100ml （现配现用，棕色瓶保存） 5 测蛋白用：

考马斯亮蓝G-250：称100mg 考马斯亮蓝G-250 + 50ml 95% 乙醇溶解 + 85% 磷酸100ml + H2O定容至1000ml，棕色瓶中保存 （常温下可放置一个月）

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