质粒DNA的提取实验报告

质粒DNA的提取

一、实验方法

碱裂解法抽提质粒DNA

二、实验原理

基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。 质粒DNA 染色体DNA 分子大小 小 大 构型 环状 环状 pH12.6 变性不完全 完全变性 pH4.8 复性 不能复性 三、实验步骤

1）质粒提取

1. 10,000g,1min离心收集1.5－5ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。 2. 加入100?l溶液1，振荡至彻底悬浮。

3. 加入200?l溶液2，立即轻柔颠倒离心管6次，使菌体充分裂解，随后将离心管冰上放置3分钟

4. 加入150?l溶液3，立即温和颠倒离心管数次，冰上放置3分钟，10，000g离心10min。 5. 将步骤4的上清转移至新的离心管（尽量去除杂质），加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10，000g离心5min。

6. 将步骤5的上清转移至新的离心管，加入2倍体积的无水乙醇，室温放置5－10min，沉降DNA

7. 10，000g离心10分钟,弃乙醇，保留沉淀，加入1ml 70％的乙醇洗涤沉淀， 10，000g离心5分钟

8. 倒掉乙醇溶液，用吸水纸吸净管壁上的水珠，室温蒸发痕量乙醇 9. 加入适量含RNase的TE或灭菌双蒸水溶解质粒DNA 2）质粒鉴定?琼脂糖凝胶电泳

灌胶：胶中加入荧光染料(SYBR Green I) 加样：质粒+上样缓冲液?混匀 电泳

结果观察：UV灯下

四、实验结果 五、实验分析

裂解细胞中除含有质粒DNA外，还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂类等物质，因此用碱裂解法除去杂质

1、防止DNA裂解：Solution 1 1）、所含糖增加溶液黏度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切作用降解 2）、所含EDTA抑制酶活性 2、溶解与变性：Solution2

1)强碱使质粒DNA和染色体DNA变性

2）离子型表面活性剂SDS可溶解膜蛋白 3、沉降与复性：Solution3 1)质粒DNA复性

2）在钾盐中，染色体DNA形成缠连的不溶性网状结构，和不稳定的大分子RNA以及变性的蛋白质和细菌碎片等一起沉淀 预期结果为剩余质粒DNA 4、琼脂糖凝胶电泳 1）荧光染色

染料分子可嵌入双链DNA分子配对碱基之间

2）琼脂糖可起到电泳和分子筛的作用，因所带电荷、分子量大小和构型不同，泳动速度不同

六、误差分析

实验失败，本组实验出现4条带，3明1暗，明亮处应为DNA分子数最多的，为质粒DNA，质粒DNA前有较暗的两条带，推测其中一条为未复性质粒DNA，可能Solution2处变性过长，不易复性，或Solution3处时间过短，复性不充分。另一条，RNA-DNA杂交链？因染料分子可嵌入双链DNA分子配对碱基之间。因还有一条在亮带后，推测为染色体DNA，推测很大可能性是Solution3处时间过短，沉降不完全。