《生物技术大实验》实验指导书--重庆邮电学院

实验九 限制性内切酶酶切法鉴定重组质粒

实验目的

掌握单、双酶切的技术，理解酶切法进行重组质粒进行鉴定的原理。

实验原理

(一)酶切

各种限制性内切酶能专一地识别碱基顺序，例如，EcoRⅠ酶的识别顺序为：GAATTC；Scal I

酶的识别顺序为：AGTACT，用EcoR I和Scal I同时酶解含有这两个单一酶切位点的环状双链DNA分子，就产生两条带有相应酶切位点的线性DNA分子。

当EcoR I和Scal I同时酶切一个质粒DNA时，酶切反应必须完全。不同酶切反应都需要Mg2+并要求一定的盐离子浓度，但不同的酶达到最佳酶切效率所需的盐浓度不同。因此生产厂商在销售酶的同时往往附带专门的缓冲液。如果盐离子浓度使用不当，会使酶的识别位点发生改变，例如当盐离子浓度低于50mmol／L时，EcoR I内切酶的专一性就降低，只能识别中间的4个核苷酸序列(称该酶为EcoR I*)。绝大多数酶的反应温度是在370C，酶切反应时间需30min、60min以至2h以上。一般来说，如酶的纯度不佳，酶切时间不能太长。终止酶切反应时，大多数可在65℃水浴中，保温10min，就可使大部分酶失活。EcoR I酶臵65℃水浴中，保温10min，丧失95％的酶活性。内切酶一般都保存在50％甘油的缓冲液中。当保存在10％甘油中时，酶活力丧失更快。少数较耐热的酶，在加热前先加pH7.5的EDTA，至终浓度为10mmol／L。EDTA螯合了反应系统中所有的二价阳离子，就更便于终止酶切反应。

酶切要完全，酶解的数量也要适当。设计酶解DNA的数量时，除了根据连接与转化的要求外，还要按照DNA浓度的高低，酶液单位的高低等具体情况而定。同时还要考虑到DNA每经一步处理，就得重新纯化，这样DNA浓度的损失量几乎达到50％。并且每经一步操作后，都要取一定量的DNA样品进行电泳鉴定或作为电泳对照样品。因此，在设计酶解数量时，不能用量太少，但是酶解数量过多，势必要消耗大量限制性内切酶和DNA，这也是不必要的。

至于酶的用量，一般的做法是控制在1U酶在15—20μl中酶解1μgDNA，但具体地分析应该对不同的DNA，酶的用量有所不同，如EcoR I酶对4．3kb的pBR322有一个切点，而对14.5kb的pXZ 6有两个切点，如果不考虑其他构型的影响，则每微克pBR322的酶用量与每微克pXZ6的用量之比应该为1.69：1(酶单位)。

酶解的体积，一般酶切0.2～1.0μg的DNA时，控制反应体积为15～20μl。根据酶解DNA的数量，按比例适当放大体积。如果酶切反应总体积太大，使DNA浓度与限制酶浓度稀释，分子之间难以接触，酶切效果就差，因而尽可能做到反应体积为最小。但是，酶切反应混合物中甘油的含量不能超过5％，否则将会抑制酶的活性(通常将酶量控制在反应总体积的1／10以下)。当使用的限制酶活性不高时，必须加大限制酶的用量。这时为了酶的用量体积不超过反应总体积的10％，其酶切

7 反应体积不可能保持到最小。另外，由于我们提取到的DNA，大多都是保存在TE缓冲液中。如果DNA浓度很稀，加入反应系统中的体积要增大，这时TE中的EDTA将会与酶的激活因子螯合，影响酶切效果。为此，也不得不放大反应体积或者将DNA重新浓缩。

24

双酶切时需要注意以下几点：（1）如果所用两种酶的反应条件完全相同（温度、盐离子浓度等）那么，可以将它们同时加到一个试管中进行酶切。（2）如果所用的两种酶对温度要求不同，那么要求低温的酶先消化，要求高温度的酶后消化，即在第一个反应结束后，加入第二个酶，升高温度后继续进行酶切。（3）如果两种酶对盐离子浓度要求不同，则要求低盐的酶先消化，要求高盐的酶后消化，具体方法是：在低盐缓冲液中加入第一个酶，反应结束后，补加1/10体积的高盐缓冲液，加入第二个酶再消化，或第一个反应结束后抽提DNA，再用高盐缓冲液酶切。目前，各试剂商都提供了双酶切缓冲液或通用缓冲液，可以根据说明书进行操作。 (二)酶切鉴定重组质粒

当空质粒载体的多克隆位点插入外源DNA片断后，可以利用插入两端的限制性内切酶进行酶切对外源片断的重组进行鉴定。如果插入外源片断，两种酶的单酶切将会产生比空质粒大的片段，在电泳上表现为滞后片断。进行双酶切后将得到2条片断，一条和空质粒大小一致的片断令一条与插入片断一样大。

实验内容

试剂与器材

试剂

(1)10×酶切缓冲液(购酶时随附) (2)EcoRⅠ酶；BamH I酶。 (3)无菌水。

(4)质粒pNTE-EGFP。 (5)琼脂糖。

(6)10mg／ml溴乙锭溶液。 (7)DNA分子量参照物（marker）。 (8)50×TAE电泳缓冲液。 (9)10×溴酚蓝上样缓冲液。 器材 (1)恒温水浴 (2)电泳槽 (3)电泳仪 (4)电炉 (5)紫外线检测仪

(6)移液器； 10-100μl,0.5-10μl

实验步骤 酶切

25

(1)设计单酶切反应和双酶切反应。

(2)分别加入无菌水于0.5m1离心管中。

(3)分别加人10×酶切缓冲液(反应总体积的1／10)。 (4)分别加入pNTE-EGFP质粒DNA。

(5)分别加入EcoR I；BamH I酶和EcoR I+ BamH I酶。酶量的加入通常是其活力的5-10倍.同时做一个pEGFPN3质粒DNA的EcoR I单酶切。 例如: ddH2O 12μl 10×酶切缓冲液 2μl DNA(1μg) 5μl EcoR I（或）BamH I 1μl 20μl

ddH2O 11μl 10×酶切缓冲液 2μl DNA(1μg) 5μl EcoR I 1μl

BamH I 1μl

20μl (6)混匀，离心5s。 (7) 37℃，1h。

(8)加入3μl 10×溴酚蓝上样缓冲液混匀后进行1％的琼脂糖凝胶电泳，成像观察。

电泳

（9）称取1.0 g琼脂糖，加入100ml 1×TAE电泳缓冲液中。 (10) 加热或沸水浴后使琼脂糖溶解。

(11) 凝胶冷至60℃左右，加入溴乙锭至终浓度为0.5μg／m1。

(12) 将琼脂糖溶液倒人模具，凝胶厚度一般为0.3～0.5cm，检查有无气泡。室温下15～30min后，琼

脂糖溶液完全凝固。

(13) 连接电泳槽与电泳仪之间的电源线，正极为红色，负极为黑色。 (14) 取掉模具两端的胶布，放入电泳槽，加样孔在负极端。

(15) 加入1×TAE电泳缓冲液至电泳槽中，液面高于胶面1mm，小心取出梳子。 (16) 在DNA样品中加入1／10的上样缓冲液并混匀。

(17) 用移液器将DNA样品加入梳孔中。电泳样品为：酶切样品；酶切前的对照样品；分子量参照物 (18)接通电源，DNA样品往正极移动。电压选择为3～5V／cm。注意：长度以两个电极之间的距离计算。

(19)根据指示剂迁移的位臵，判断是否终止电泳；切断电源后，含EB的凝胶可以直接于紫外线灯下观察结果或拍照记录。

26

注意事项

1. 酶切反应的影响因素很多，操作时首先要保证质粒DNA的纯净，样品中过高的盐分和痕迹量的酚等都会使酶切反应无法正常进行。

2. 酶切反应在冰上进行.严格控制内切酶的用量在总反应体积的1/10，否则，甘油浓度过高会抑制酶活性。不同的酶使用不同的反应液,注意相符合.双酶切时选择两种酶活性均较高的反应液,不能选择合适的反应液时,先使用低盐反应液,加入相应的酶,然后补加一定的盐离子和对应的酶. 3. 尽可能地降低反应总体积，增大酶与底物间的碰撞机会，增加反应速度。

4. 倒胶时不能有气泡留在胶层中，电泳时注意去除模具两端的胶布和正负极的对接。

【思考题】

1． 2． 3． 4． 5．

【课外阅读】

大连宝生物公司限制性内切酶说明书.

美国New England biolabs公司说明书,网站:www.neb.com

什么是星号活性？

DNA的酶切实验要注意那些问题？

双酶切的缓冲液应满足什么条件？如何解决？ 使用EB时应注意什么问题？

在做琼脂糖凝胶电泳时应注意什么问题？

27