《生物技术大实验》实验指导书--重庆邮电学院

实验内容

材料 小鼠新鲜肝

试剂 总RNA提取纯化试剂：Trizol(Invitrogen)；DEPC(Amersham) 无水乙醇，已丙醇；

RT-PCR试剂盒 TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV)（大连宝生物生物公司）

本试剂盒采用了一步反应法（One Step法）完成RT-PCR反应。RNA→cDNA→PCR反应操作在同一反应体系中进行，反应中途不需添加任何试剂，就可以完成由AMV（Avian Myeloblastosis Virus）由来的反转录酶从RNA反转录为cDNA，再由AMV-Optimized Taq扩增cDNA的全部反应。本试剂盒中含有进行One Step法RT-PCR反应用的全部试剂，可以简便而有效地对RNA进行扩增分析。

本试剂盒中的Control RNA是以pSPTet3质粒（质粒中的SP6启动子下游插入长约1.4 kbp的pBR322来源的DNA片段，其DNA片段上含有抗四环素基因）为模板由SP6 RNA聚合酶经

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体外转录而得到的。Control RNA（约1.4 kb）是带有30个A碱基的具有Poly(A)+尾的RNA。当把Control RNA经RT-PCR合成的双链cDNA插入质粒时，该质粒便可获得四环素抗性。

操作步骤

1总RNA的提取根据上次实验总RNA的提取进行。

2 按下列组成配制RT-PCR反应液。

3 按以下条件进行RT-PCR反应。

当RNA为Positive Control RNA时，反应条件如下。

4反应结束后，取PCR反应液 (5 –10ul) 进行1%琼脂糖凝胶电泳，确认RT-PCR反应产物。 如果此PCR产物需用于以后实验，应将PCR产物冷冻保存。 Control反应时扩增片段大小为462 bp。

思考题 一步法和两步法RT-PCR的有何差别，在实际应用上体现在哪些方面？

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实验十三 DNA探针制备

实验目的

了解双链DNA的缺口平移和随机引物标记法的原理以及掌握其技术。

实验原理

在基因分析的杂交方法中几乎都用到同位素或非同位素标记的探针。制备探针的方法有DNA缺口平移标记、随机引物标记、DNA末端标记、寡核苷酸末端标记、引物延伸法标记、RNA探针标记以及非同位素标记等。每一种标记方法有各自的特点和适用范围。

缺口平移标记法

原理 DNA酶I是一种核酸内切酶，它可在DNA两条链上随机酶切形成缺口，缺口的3＇端为3＇-OH。DNA聚合酶I具有5＇→3＇外切酶活性和依赖引物和模板的5＇→3＇聚合酶活性。在缺口上DNA聚合酶Ⅰ沿5＇→3＇将缺口端的5＇-单核苷酸切除，同时将游离的dNTP加在缺口的3＇-OH上，结果使缺口沿DNA平移(Nick translation)。如果添加的dNTP中含一种或几种[α-32P]dNTP，那么双链DNA就带上很高比活度的放射性(108cpm／μg)，掺入效率>65％。

随机引物标记法

原理 随机引物标记法DNA用量少(25ng)，同位素掺入较高(60％左右)，最高放射比活度超过1×109cpm／μg。随机引物结合于线性变性单链DNA模板的多个位点，在Klenow酶作用下进行5＇→3＇引物延伸反应，标记同位素的dATP就随此过程掺入，一般可合成250—300 bp的标记探针(模板大于500bp)。

实验内容

缺口平移标记法

材料 DNA酶(DNaseI)、DNA聚合酶I(Promega公司试剂盒提供按一定比例混合的混合物)。[α-32P]dATP、dGTP，dCTP，dTTP(各300μmol／L)；缺口平移缓冲液(10×)，待标记DNA 1μg，终止液(0．5mol／LEDTA)。

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方法

(1)混合下列试剂：

试剂

dCTP、dGTP、dTTP混合液各30μmol／L 缺口平移缓冲液 10× DNA

[α-32P]dATP(100mCi/ml)

DNA酶I和DNA聚合酶I混合液 ddH2O 总 计

(2)15℃反应60min。 (3)加5μl终止液终止反应。

(4)-20℃保存备用，如立即使用一般保存在4℃或0℃。

体积 10μl 5μl 1μg 5μl 5μl 24μl 50μl

随机引物标记法

材料 Klenow酶，[α-32P]dATP，dTTP，dGTP，dCTP，10 ×标记缓冲液(900mmol／L HEPES，MgCl2 100mmol／L，pH6.6)，待标记DNA 25ng。 20

方法

(1)DNA(25ng溶于TE或H2O)95～100℃变性2min，迅速臵冰浴中。 (2)加入下列试剂：

试剂

dCTP dGTP dTTP混合液各500μmol 标记10×6μg

[α-32P]dATP(100mCi/ml) Klenow酶 ddH2O 总 计

(3)室温反应60min。

(4)95～100℃加热2min并臵冰浴以终止反应。

体积 2μl 5μl 5μg 5μl 33μl 50μl

标记探针的纯化 1．沉淀法(适用于>18bp的探针)

(1)标记反应混合物(20μl)中加入40μl水。

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