荧光定量PCR步骤

2.3.2 反转录反应

2.3.2.1去除基因组DNA反应

按如下成分于冰上配制反应混合液，为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制Master Mix，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品。

试剂 5×gDNA Eraser Bμffer gDNA Eraser Total RNA RNase Free dH2O 使用量 2.0 μl 1.0 μl 1μg μp to 10 μl 42℃水浴2 min，冰上放置。 2.3.2.2 反转录反应

反应液配制请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配制Master Mix，然后再分装10 μl 到每个反应管中。轻柔混匀后立即进行反转录反应。

试剂 步骤1的反应液 PrimeScript RT Enzyme Mix I RT Primer Mix 5×PrimeScript Bμffer 2 RNase Free dH2O Total

使用量 10.0 μl 1.0 μl 1.0 μl 4.0 μl 4.0 μl 20 μl PCR反应程序，37℃ 15 min，85℃ 5 sec，4℃保温后。用核酸检测仪检测cDNA浓度，保存于-20℃ 。

2.3.3.2 Real Time PCR

应用Thermal Cycler Dice Real Time System扩增仪的操作方法 1) 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

试剂 SYBR ? Premix Ex Taq II PCR Forward Primer PCR Reverse Primer RT反应液 Rox dH2O（灭菌蒸馏水） Total 使用量 10μl 0.8μl 0.8μl 0.4μl 6μl 20μi 2) 进行Real Time PCR反应。 采用两步法PCR反应程序 Stage 1：预变性 Repeat：1 95℃ 30秒 Stage 2：PCR反应

Repeat：40 95℃ 5秒 60℃ 30-60秒