新型无机纳米载体的构建及其药物 - 基因的高效传递研究 - 曹霞

1.2.1.3实验动物

比格犬,雄性,10士Zkg(南京安立默科技有限公司) 1.2.2实验方法

1.2.2.1HpLC法测定血浆中SLBM含量

血浆中SLBM的含量按游离SLB计算,运用本实验室建立的HPLC法测定新型无机纳米载体的构建及其药物思因的高效传递研究

血浆中游离SLB浓度\色谱条件包括以下几个部分:色谱柱:Nova一packC18, 150~火3.9mm;流动相:甲醇众05mol.L一,磷酸氢二钾一9.9:H,调pH至3.8; 流速:1ml/mln;柱温:37.5e;检测波长:288nln\1.2.2.23d一sLBM的犬体内药动学研究

分别选取6只比格犬,给药前禁食12h分别给予相同SLB(ZI.Zm眺g)的

对照制剂(西利宾胺片)和3d一SLBM,给药后分别于不同时间点0.25,0.5,1, 2,4,6,8,10,12,16,24,36,48,60,72h前肢静脉取血4ml,血样用肝

素抗凝,离心取血浆,血浆于一20e保存测定,实验期间,给药4h后统一进食\1.2.2.3游离水飞蓟宾的提取

取200贝的血浆加入离心管中,分别加入内标(10协留ml的a一蔡酚甲醇溶液) 20林l!0.2moFLKHZPO4溶液200林l!甲醇20林l!乙醚sml,涡旋5min,3000印m 离心10min,取上层有机层4ml至另一洁净离心管中,于30OC水浴中氮气吹干\残渣用100闪流动相溶解,进样\2.3 2.3

实验结果

1犬体内血药浓度 -xilibinanPian .,减~3d#SLBM 36月习6072 一:一2 一

20015010040035030025050\

(工uJ工比ua\一妇巴lu\任s\一d Ti11祀(h)

图2.6口服水飞蓟宾葡甲钱盐2种制剂的犬体内经时平均_血药浓度曲线(n二6) F192.6MeanPlasmaeoneentration一timeeurvesofsilybinmeglumineafteroral administrationofZPreParationsinbeagle(n=6)

两只比格犬口服SLBM的2种制剂后血浆中游离SLB浓度的经时血药浓度 见图2.6, 2.3.2

与市售制剂西利宾胺片相比,3d一SLBM具有显著的高效!缓释作用\药动学参数的计算

用BAPP2.3药动学计算程序(中国药科大学药代中心提供),计算药动学参 数\根据AIC法和F检验的方法拟合隔室模型\江苏大学博士学位论文 1.2.3.2.1房室模型药动学参数

本文用AIC法和F检验进行房室模型判断,结果为3d一SLBM和对照制剂药 物犬体内药动学数据都较符合一室模型,用BAPP2.3药动学软件对血药浓度数

据进行处理,计算相关参数\结果见表2.2\

表2.2一室模型3d一SLBM和对照制剂犬体内游离血药浓度药动学参数

几b2.2PhannacokinetieParametersof3d一SLBMandeontrolPreParationfree一drugindogswith

one#comPartmentmodel

DoseCmaxTmaxtl泛MRI,AUCo一co Forlnulations

(mg/kg)(ng/ml)(h)(h)(h)(hng/ml)

3d一SLBM21.2315.262413.1638.8920265.39 XilibinanPian21.2324#770#54.177.312552.77

根据一室模型拟合药动学数据(表2.2),3d一SLBM的Tmax明显大于对照制 剂;3d一SLBM的游离药物Cm\大于对照制剂;3d一SLBM的MRT较对照制剂有 很大的延长;药时曲线下面积AUC3d一SLBM也明显大于对照制剂\1.2.3.2.2非房室模型药动学参数

采用非房室模型依赖法处理3d一SLBM犬体内的血药浓度数据,求算药动学 参数\结果见表2.3\

表2.3非房室模型计算3d一SLBM游离血药浓度药动学参数

几b2.3PharmacokinetieParametersof3d一SLBMfree一drugwithnon一eomPartmentmodel

DoseCmaxTmotl泛MRI,AUCo一, Forlllulations

(mg/kg)(ng/ml)(h)(h)(h)(hng/ml)

3d一SLBM21.2324.77241093.8932.85587663.32 XilibinanPian21.2540习114.845.151114734

根据非隔室模型法拟合药动学数据(表2.3),3d一SLBM的Tmax明显大于对 照制剂;3d一SLBM的MRT比对照制剂有较大的延长;药时曲线下面积明显大于 对照制剂\其结果与采用隔室模型计算结果相同\1.2.3.2.3相对生物利用度

生物利用度(Bioavailability,BA)是指药物被吸收进入血液循环的速度和程

度\有绝对生物利用度与相对生物利用度之分\同一种药物不同制剂之间比较吸新型毛少纳米载件的壑垫鱼丝些些丝竺壑丝鱼一一

收程度与速度称为相对生物利用度,当受试制剂和参比制剂剂量相同时:计算公 式如下:

Fr=A口CTA口CRx100%(公式2.4)

由公式2.4计算结果可得,以对照制剂为参比,3d一SLBM中药物的相对生物 利用度可达803.99%,说明3d一SLBM的生物利用度较市售对照制剂显著提高\1.2.3.3.4体内外相关性研究

对3d一SLBM的生物利用度评价,除了以上进行的相对生物利用度的比较! 生物等效性的检验,还需要进行体内外相关性的研究\其主要原因在于生物利用 度是评价药物制剂质量的一项重要指标,但生物利用度研究需在人或动物体内进 行,不可能作为常规的产品质量控制手段\体外释放度测定可以在一定程度上反 映药物制剂在体内的吸收,而且实验手段简单方便,但释放度测定方法必须被证 明是合理的,即体外释放度与体内生物利用度之间有良好的相关性\体内外相关 性的证明一般有三种方法:其一,可以应用统计矩分析原理建立体外释放的平均

时间与体内平均滞留时间的相关;其二,可以建立一个释放时间点与一个药代动 力学参数(如AUC或Cmax或Tmax)之间的单点相关;其三,亦可以通过比较制 剂体内吸收分数和体外累积释放分数完成,即点对点的多点相关法\其中,点对 点相关更能反映吸收与溶出的全程关系,由体外溶出可以直接反映体内吸收的情 况\

计算体内吸收分数的方法有Wagner一Nelson法和Loo一Riegelman法,后者适 合于二室模型药物,前者适合于一室模型药物\本文中3d一SLBM游离血药浓度 数据拟合符合一室模型,因此采用Wagner一Nelson法计算体内吸收分数\中国药 典2010年版规定体内吸收相的吸收曲线与体外释放曲线的各个时间点回归,得 到的直线方程的相关系数大于临界相关系数即可确定体内外相关\由于SLBM 体内药效主要依赖其游离SLB的浓度,本文仅建立了游离药浓与体外释药的相 关性\吸收分数计算公式如下: 厂=c,+!fCldtx100% -fCtdl(公式2.5)

将体内吸收分数与体外释放分数回归直线方程,其相关系数r与按自由度查江苏大学博士学位论文

表所得临界相关系数进行比较\

本文体外释放分数的测定采用透析法在模拟肠胃液的体液中长时间释放量 低于10%,为了保证体外释药样品与体内一致性,我们将3d一SLBM称取适量装 入透析袋中,置NaZC03的溶液中,释药环境保持在(37士1e,70士5次/min) 的水浴振荡器中,定时取样lml并更换介质,样品稀释10倍后于288nm处以空 白纳米粒的释放介质为对照,测定吸光度,根据标准曲线计算体外累积释放分数\3d一SLBM体外释药分数Fr和体内吸收分数Fa计算结果及回归方程相关系数见 表2.4\

表2.4体内外相关性数据

几b2.4Resultsofeorrelationinvitroandinvivo t(h)0.250.51246810

游离浓度Fa(0,o)9#8212#3314#3618#3222#3229#3834.740.36 累积释放率F:(0,o)33#8837#9538#1740#3844#5348#950.3552.65 t(h)12162436486072/ 游离浓度Fa(%) 累积释放率Fr(%) 44.6150.7863.82 54.9256.8560.83 76.4290.2699.82100 64.4369.0473.0977.36 r0.9965

查r界值表,当自由度v为9时,临界值r9,\一0.602,可见回归方程的相关 系数r>r9,\表明该方法能够建立3d一SLBM体外与体内游离药浓的相关性指 标,为制剂的进一步发展建立了良好的体外评价体内的手段\1.33d一SLBM的药效学评价 1.3.1实验材料 1.3.1,1主要试剂

梭甲基纤维素钠(CMC一Na)(粘度:800一1200,国药集团化学试剂有限公

司);西利宾安TM(水飞蓟宾葡甲胺片,江苏中兴药业有限公司);四氯化碳(AR, 江苏徐州试剂二厂);芝麻油(江苏镇江市京口香海麻油厂,中国);丙二醛(MDA) 试剂盒(南京建成生物工程研究所);考马斯亮兰试剂盒(南京建成生物工程研 究所);3d一SLBM自制\

1.3.1.3仪器新型无机纳米载体的构建圣甚塑丝翌些型丝燮塑二一一一一一 紫外分光光度计(uv-2401Pc岛津,日本);Biofuge台式高速冷冻离心机 (Heraeus,德国);FfukoEA25高速剪切机(上海弗鲁克流体机械制造有限公 司);恒温振荡水浴锅(江苏省金坛市医疗仪器厂);电子天平(XTI20APrecisa, 瑞士);恒温振荡水浴锅(江苏省金坛市医疗仪器厂);全自动生化仪(奥林巴斯 AU27OO, 3.1.4 日本)\动物

清洁级IeR小鼠(体重20一249,雄性,扬州大学比较医学中心);饮水: 冷却开水\温度:24一26oC\光照:10hjdo 3.2 3.2

实验方法 1药物配制

将各组药物均匀混悬在浓度为0.5%的CMC一Na溶液中\3.2.2ccl4溶液配制

取适量CC14和芝麻油混合均匀,配成0.3%(v/v)的溶液\3.2.3 3.2.3 实验方法

1动物分组及给药方式

小鼠随机分为4组,每组12只\其中西利宾安组灌胃给药,剂量为28.4

mg/kg/d(按SLB计),共15d;3d一SLBM组灌胃给药,剂量为85.2mg/kg/3d(按 SLB计),共巧d;除了空白组不加任何处理外,第巧天,各组小鼠均一次性灌 胃0.3ì14芝麻油溶液sml瓜g(染毒之前禁食不禁水17h),16h后取血,处 死\

1.3.2,3.2样本预处理

血浆:小鼠摘眼球取血,6000r/min离心10min分离血浆,低温保存,检测 各组小鼠血浆中ALT和AST水平\

肝组织样品:颈椎脱臼处死小鼠后,取小鼠0.39肝组织,用0.86%生理盐

水制成10%的肝组织匀浆,3100r/min离心13min取上清液,按试剂盒说明书测 定肝组织匀浆中的MDA含量\1.3.2.3.3MDA含量的测定

采用硫代巴比妥酸法(ThibabituricAcid,TBA)测定MDA含量,以考马斯亮

蓝法测定蛋白含量\与MDA在酸性条件下煮沸生成红色化合物,在波长江苏大学博士学位论文

532nln处有最大吸收峰,按如下公式计算: 测定管口D值一测定空白管口D值

组织中MDA含量标履晋面面标难王石音瓦画直义