新型无机纳米载体的构建及其药物 - 基因的高效传递研究 - 曹霞

较低的阳离子多聚物虽然毒性较低但存在DNA缩合能力有限,复合物胶体不稳 定性以及细胞转染能力低的缺陷\另外进行体内基因输送研究时发现,阳离子多 聚物一DNA复合物在体液中不稳定,容易同血浆蛋白组分结合后清除!降解[64]\

因此,阳离子聚合物同样仅限于体外基因转染,其体内转染效率仍然不容乐观\新型无机纳米载体的构建及其药物噬因的高效传递研究 2.4纳米基因载体系统

现存病毒载体的安全性问题与非病毒载体的低传递效率等问题己经成为限 制基因治疗进一步发展的瓶颈\

随着纳米生物技术的飞速发展,一种新型的非病毒载体系统一一纳米基因载 体系统的出现为基因治疗注入了新的活力\

纳米基因载体是将DNA!RNA!PNA(肤核甘酸)!dsRNA(双链RNA)等基

因治疗分子包裹在纳米颗粒之中或吸附在其表面,同时也可在颗粒表面偶联特异 性的靶向分子,通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合,在细胞摄取作用下进 入细胞内,实现安全有效的靶向性药物和基因治疗[65一68]\

纳米载体在介导基因转移方面具有以下优势:(l)由于是非生物材料,无免疫 原性,不会引起机体的免疫反应;(2)与病毒载体不同,它无遗传毒性与细胞毒 性,不会导致细胞的转化和细胞死亡;(3)由于其特殊的结构及表面电荷,具有 很高的基因转移效率;(4)可介导外源基因在宿主细胞染色体DNA中的整合,从 而获得转基因的长期!稳定表达;(5)纳米载体可保护转导基因不受机体血浆或 组织细胞中各种补体以及各种酶的破坏,有利于目的基因在转导进入靶细胞后能 更好!更稳定的发挥作用;(6)由于具备较小的粒径,容易逃避体内巨噬细胞的 吞噬,更利于被靶细胞捕捉;(7)纳米粒本身具有抵抗或杀死一些病毒的作用,

包括对Hlv的杀灭作用,它即可作为载体,同时又可作为一种药物而被应用[69一7-l\多孔二氧化硅纳米粒作为一类新型的药物载体材料,因其具有性质稳定!生 物相容好!无毒!可/官能化0等特点而倍受人们关注\从DNA一纳米粒的形成 过程看,一般由带负电荷的DNA与带正电荷的材料通过静电作用缩合而成,对 于带负电荷或电荷较弱的多孔二氧化硅纳米粒,必须先阳离子化修饰以提高其电 位,已有的方法主要包括胺基偶联!阳离子聚合物包裹=72]等\

综上所述,纳米基因载体是目前常用的非病毒基因载体中较为出色的一种, 且有望发展成为一种理想的基因载体\因此,本课题将以无机磷酸钙纳米粒基因 载体为研究对象展开深入的研究\2.5纳米材料的选择

与生物不可降解载体相比,生物可降解载体具有潜在的优势,如:安全性!

生物相容性!结构可设计性!粒径可控性!稳定性!缓释性并且能够避免在反复 给药后聚合物在体内蓄积等[73l\江苏大学博士学位论文

所谓生物可降解聚合物是指一些能够在水!酶作用下降解的高分子聚合物, 包括天然生物可降解高分子材料及合成生物可降解高分子材料\其中,合成的生 物可降解材料具有更易于获得!质量稳定!生物惰性!降解速度可调节性和良好 的可塑性等优点,可满足不同类型药物的制备要求,得到了广泛应用\制备纳米

粒的合成生物可降解高分子聚合物有[74一77]聚酷!聚酸醉!聚酞胺!聚氰基丙烯酸 酷和聚磷睛,其中聚乳酸pLA(polylactieaeid)和聚乳酸一乙醇酸共聚物[poly(D, L一lactide一eo一glyeolide),pLGA]是美国FDA批准通过的药用辅料[78,79],己被广泛

地应用于生物医学工程领域,如生物体吸收性缝合材料,内置隔离材料,骨科固

定及组织修复材料\

但是这些合成生物可降解材料在体内降解较慢,连续给药可产生蓄积,其单 体和降解产物有一定的毒性,因此前景有待更深入地评价\而无机材料钙是人体 的天然成分,在体内有固定的降解途径,生物相溶性好,比高分子材料毒性更低, 且制备工艺简便,所以有望成为一类很有前途的新型纳米药物载体\

本文用反相微乳法制备得到不同于天然磷酸钙的颗粒状纳米级的粒子,加入 多糖修饰,其表面的zeta电位可以对药物有吸附作用,以它作为药物的载体, 研究其在干细胞中的转染情况\2.6展望

纳米粒是一类极具开发潜力的新型药物载体,以纳米粒作为载体的药物DDS 克服了传统药物传递系统的许多缺陷和无法解决的问题\纳米粒作为新型载体, 具有很多优势,如无免疫原性!细胞毒性,有较高的基因转移效率,可获得靶基 因的长期稳定表达,因此在转运基因!运载多肤和蛋白类药物!输送免疫调节剂! 抗肿瘤药!抗病毒药和输送抗原或疫苗等方面有着广泛的应用前景\以纳米颗粒作为基因载体就是将DNA!RNA!PNA(肤核甘酸)!dsRNA(双

链RNA)等基因治疗分子包裹在纳米颗粒中或吸附在其表面,在细胞作用下纳米 颗粒进入细胞内,释放基因治疗因子并发挥基因治疗效能[82,83]\

纳米基因转运体的研制是目前国际纳米生物和肿瘤基因治疗研究领域重要

的前沿性课题,国际上已相继研制出树枝状聚合物(dendrimers)!聚氰基丙烯酸 烷基酷!聚丙交酷等纳米基因载体,国内业已研制成功了多聚赖氨酸硅纳米颗粒 [84,05]\随着纳米制剂不断的发展,纳米颗粒作为载体转染基因将会在基因治疗 中发挥更重要的作用\新型无机纳米载体的构建及其药物/基因的高效传递研究 3组织工程软骨种子细胞的定向诱导分化 3.1组织工程概述

体内大多数组织细胞存在于三维的组织结构中,研究发现186],三维系统更接 近体内功能状态,其较高的细胞密度更有利于工程化组织的形成\如果应用组织 工程替代和修复体内具有三维结构的组织和器官,就需要三维细胞培养方法所构 建的细胞一载体复合物\

组织工程的核心是建立由种子细胞!支架材料及生长因子构成的三维空间复 合体\不同种子细胞的增殖!分化能力不同,选择合适的种子细胞是构建组织工 程软骨的首要问题\理想的种子细胞应具备:取材方便!损伤小!增殖分化能力 强!植入体内能高效修复软骨缺损并保持远期疗效等特性\缺乏合适的种子细胞 一直是限制软骨组织工程发展和应用的主要瓶颈\支架材料可以作为细胞与生长 因子的传递系统为复合的细胞提供初期的结构支持,并在细胞生长及分泌自身基 质的过程中逐渐降解,起到细胞外基质替代物的作用\三维支架材料的选取要求 除有良好的生物相容性!三维立体多孔!连通结构,还要有与天然松质骨相似的 表观弹性模量\三维空间支架有利于细胞自分泌!旁分泌的相互调节,特别是有 骨细胞形成的组织,有利于自我组织过程的形成\

目前可用于基因缓释的支架材料有187,/8]:细胞外基质(Extracellularmatrix, EcM)!天然或合成的高分子及其共聚物等,其中EcM卿]是由邻近细胞分泌的 蛋白纤维!蛋白聚糖和非纤维蛋白等成分通过化学和物理交联组成的具有三维结 构的网状结构,是细胞附着的基本框架和代谢场所,它的形态及功能直接影响其 所构成组织的形态及功能,为组织和细胞的生长提供支撑和弹性,与细胞特别亲 合!易于模拟体内环境\等将胰岛素样生长因子的基因与脂质体转染试

剂复合后,与ECM(胶原一氨基聚糖)三维支架交联,在两周培养期内仅释放出 约1%,连续表达的胰岛素样生长因子可显著促进组织的再生\3.2种子细胞定向诱导分化成软骨方法

种子细胞是体外构建组织工程组织!器官最为重要的材料,软骨组织工程更 是以大量表型稳定的种子细胞为基础\目前研究较多的种子细胞主要有:MSCS, 属于成体干细胞,具有在特定的组织发育区聚集的能力,并最终发育形成某种特

定的组织或器官[90一83],并在局部的趋化因子和细胞因子作用下迁移分化,最终完江苏大学博士学位论文

成组织的修复\来源丰富,主要有骨髓!脂肪!肌肉!胎盘!骨膜及软骨 膜等\研究证明,经一定条件培养,这些MSCs均能够转化为软骨细胞\骨髓间 充质干细胞是目前研究最多的种子细胞之一\

软骨定向诱导分化研究的深入,为临床上运用软骨组织工程学来解决关节软 骨缺损修复这一难题提供了有效依据,有广泛的临床应用前景\软骨定向诱导分 化是一个复杂的过程,需要合适的刺激因子!适时!适量地发挥刺激和推动软骨 分化作用,一直是组织工程研究的难点和热点\

目前较为公认TGF一p(Transforminggrowthfactor一p,TGF一p)!胰岛素样生 长因子l(insulinlikegowthfaetorl,IGF一l)!成纤维细胞生长因子(flbroblast growthfactor,FGF)!骨形态发生蛋白(bonemo印hogenetieprotein,BMp)等众多

细胞因子对这一过程可起到推动和刺激作用[94一96]\具体刺激作用方式,归纳有以 下两种[97一./0]:

加入培养介质中调控分化\细胞培养过程中,生长因子往往直接加入培养液 中,由于生长因子半衰期短,易被稀释和降解,这种/外加法0需要反复大剂量 给药,繁琐且价格非常昂贵\

以基因转染方式通过表达目的基因调控分化\细胞因子基因转染方式调控分 化=.\基因组织工程技术将基因技术引入组织工程,即转染特定基因入种子细 胞,通过目的基因的持续表达促进种子细胞增殖!分化从而构建出人工组织或器 官\通过转基因技术将生长因子基因导入种子细胞后,可使细胞自身表达生长因 子,这种/内加法0无疑是有利于组织的修复与再生\

转化生长因子一p在软骨细胞中的主要作用是刺激蛋白多糖和DNA合成,提高 软骨细胞胶原mRNA水平,增强mRNA转录后的稳定性\质降解中抵抗分解代谢, 对基质中金属蛋白酶的组织抑制剂有很强的调控作用,抑制金属蛋白酶的表达,

从而抑制胶原等细胞外基质的降解=-0.,.\一pl被公认是参与调控H型胶原代 谢关系最为密切的细胞因子,其特殊性在于其具有诱导未分化间充质细胞向软骨 细胞分化并表达H型胶原和蛋白多糖等软骨细胞表型的能力\刘方军等以脂质体 介导将TGF一plcDNA转入体外培养的猪耳软骨细胞发现,转基因细胞所表达的 TGF一困明显促进软骨细胞H型前胶原mRNA的表达,H型胶原蛋白的合成增加\

郭晓东等通过脂质体介导TGF一印基因转染MSCs移植修复兔关节软骨缺损实验新型无机纳米载体的构建及其药物/基因的高效传递研究

证实,转基因细胞可继续表达TGF一pl至少4周以上,新生的透明样软骨组织中细 胞功能活跃,基质中主要是软骨特异性n型胶原纤维;软骨下区术后2周即有活 跃的新骨和血管生成,12一14周时已完全再生\一印作为促进未分化间充质细 胞向软骨细胞转化因子显示出良好的应用前景\

本文在前期实验基础上,在三维支架中加入如含有RGD序列的FN及DNA一磷 酸钙纳米粒,形成新型三维非病毒纳米基因传递系统,这种新型的传递系统具有

高效缓释的特性,其所负载的基因的表达可达到外加因子的水平\为非病毒基因 传递及组织工程修复方面提供了新的思路\3.3展望

自基因工程技术应用于组织工程领域以来显示了其独特的优势=-\一.08]:转化 细胞可持续高效表达目的基因以调控其自身及其它效应细胞的生长;转染细胞合 成分泌的内源性蛋白具有更多可识别的配体,能更有效地同细胞表面受体结合使 其表达产物活性更高,所需产物量更小(ng或pg水平),减少了外源性重组蛋白 大剂量(mg或林g水平)反复使用的副作用等\然而,目前这一新兴的组织工程 方法仅限于实验阶段,将其推向临床还需要解决诸多问题:目前常用的BMSCs 体外扩增速度慢且代数有限,尤其它在骨髓细胞中所占比例随着年龄增长而降 低,年老个体要获得足够数量的BMSCs就十分困难:基因转移对细胞的生物学 特性的影响;人为调控目的基因的体内表达以及表达载体永久整合造成外源基因 在局部过度表达涉及的生物安全性问题等\但相信随着分子生物学技术!干细胞 培养研究以及生物材料工艺的完善,通过选择更佳的转染基因和表达性安全载 体!更合适的种子细胞和进一步明确多种因子保证种子细胞定向成软骨分化机制 等,基因强化软骨组织工程领域的研究必将会成为一种非常有希望的治疗工具和 手段\江苏大学博士学位论文

第二章新型多孔二氧化硅纳米粒在药物传递中的应用研究

多孔纳米粒是一种新型给药系统,在药学领域有着和一般纳米载药系统相同 的优点:可使药物作用具有靶向性;可缓释药物,从而延长药物半衰期;可在保 证药物作用的前提下,减少给药剂量,从而减轻或避免毒副反应;可提高药物的 稳定性,保护药物使其免受体内各种酶类的降解等\它还有自身独特的优点:具 有低密度!高比表面积!高的稳定性和表面渗透性的特点,同时其多孔的孔道部 分可以容纳大量的客体分子或大尺寸客体,从而产生一些奇特的基于微观/封 装0/包裹0效应的性质,并能产生很好的缓释作用,以多孔纳米粒用作药物的 载体具有极其广泛的应用前景\

水飞蓟宾(511油in,SLB)是从菊科植物水飞蓟(silybummarianus)中分离 提取的黄酮类化合物\水飞蓟宾葡甲胺(Silybinmegtumine,SLBM)是由水飞

蓟宾与葡甲胺(1一甲胺基一1一去氧山梨醇)合成的产品\药理研究表明,SLB与 SLBM有着相同的适应症和临床疗效对各种肝脏疾病都有不同程度的治疗作用, 已成理想的肝损伤修复药物,临床上广泛用于治疗急慢性肝炎!肝纤维化和早期 肝硬化等肝病\水溶性差,生物利用率低,严重影响了使用范围;SLBM较 SLB易溶于水,故吸收速度及疗效的发挥均较SLB为优,其剂型目前主要有普 通片和胶囊剂,生物利用度较低\

本部分以生物安全的硅胶为载体材料,运用纳米技术,自行研制出具有高效 增溶!长效缓释作用的新型多孔二氧化硅纳米粒(Poroussilicananoparticles, PSNS)\分别选择水溶性药物水飞蓟宾葡甲钱和难溶性药物水飞蓟宾为模型药

物,研究PSNs新载体在水溶性药物和难溶性药物72h高效长效制剂(3一dayrelease formulation)开发中的应用可能,为3天给药1次的高效长效新制剂开发提供技 术支撑\

1水溶性药物72h高效长效新制剂的研制 1.13d一SLBM的制备及体外质量评价 实验材料 .1主要试剂