分子生物学实验

3. 用蒸馏水彻底清洗透析袋。

4. 放在10mmol/L EDTA(ph8.0)中将之煮沸10分钟。

5. 冷却后，存放于四度，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取用透析袋时

必须戴手套。 （二） 透析除盐

1. 蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即将

蛋白质溶液装入透析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲溶液进行透析，并不断的更换缓冲溶液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。 2. 0.02％mol/LPH7.4PBS溶解蛋白质沉淀至10ml装入透析袋。

3. 4°C下，对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+

为止。

4. 取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白质含量。 方法如下：蛋白质含量（mg/ml）=1.45×OD280nm-0.74×OD260nm)×样品稀释度。

四、 仪器

（1） 烧杯

（2） 磁力搅拌器和搅拌子 （3） 离心机和转头

五、 试剂

（1） 硫酸铵

（2） 用于悬浮沉淀物的缓冲液

六、 注意事项

（1） 搅拌必须是有规则的和温和的。搅拌太快将引起蛋白质变性，其变性特征

是起泡。用磁力搅拌器不明显产热，这一点也很重要。

（2） 大多数蛋白质在盐溶解后的前20min沉淀，一些蛋白质要经数小时才能

完全沉淀。

（3） 为了平衡硫酸铵溶解时产生的轻微酸化作用，沉淀反应至少在50mmol/L

缓冲液中进行。

（4） 缓冲液应该含有螯合剂如EDTA以除去硫酸铵中微量的重金属离子，因为

这些离子对目的蛋白质是有害的。

（5） 为确保获得最大量沉淀，使用蛋白质初始浓度至少为1mg/mL。 （6） 硫酸铵沉淀反应通常是贮存和稳定蛋白质的良好方法。

（7） 少数蛋白质在硫酸铵浓度低于24%时就产生沉淀，而大多数要在80%以

上才能沉淀。在纯化的初始阶段，常利用蛋白质在硫酸铵中溶解度的差异分离蛋白质。硫酸铵沉淀可除去RNA和DNA。

（8） 在蛋白质的等电点其溶解度降低，在此条件下，静电的相互作用可导致蛋

白质凝集和沉淀，在蛋白质的等电点，低浓度的硫酸铵就能沉淀蛋白质。

（9） 在蛋白质结晶实验中，采用硫酸铵沉淀十分有效。

七．实验结果与分析

酶活力测定中吸光度的1-9组测量结果

硫酸铵沉淀法测 酶活 OD660 空白1 空白2 空白3 平均值 0.424 0.471 0.497 0.424 0.474 0.490 0.418 0.467 0.497 0.430 0.473 0.505

1 2 3 4 5 6 7 8 9 0.476 0.490 0.456 0.485 0.427 0.477 0.463 0.450 0.475 0.480 0.501 0.446 0.491 0.436 0.473 0.470 0.450 0.481 0.488 0.495 0.449 0.486 0.440 0.466 0.476 0.445 0.478 0.481 0.495 0.450 0.487 0.434 0.472 0.470 0.448 0.478

酶浓度1-9组测定结果

编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 浓度 mg/ml 0.36 0.36 0.28 0.29 0.16 0.14 0.16 0.30 0.21 A280 0.544 0.483 0.378 0.410 0.239 0.210 0.244 0.442 0.284 所以本组(7)的酶活力测定结果为0.11U，酶浓度为0.16 mg/ml

常用的盐析剂是硫酸铵，其溶解度大、价格便宜。硫酸铵沉淀蛋白质的能力很强，其饱和溶液能使大多数的蛋白质沉淀下来。对酶没有破坏作用。

pH的控制：应从酶的溶解度与稳定性两个方面考虑，在酶等电点时其溶解度最小易沉淀，但有些酶再等电点时稳定性较差，因此要选择最佳pH值.一般要求在酶最稳定的pH值的前提下再考虑最适宜酶沉淀的pH值。在操作中一旦确定最佳pH值后，在添加硫酸铵之前甲酸或碱调节好酶液的pH值，要尽量避免溶液pH值的波动以免破坏酶的稳定性。在添加硫酸铵时要注意搅拌，并注意硫酸铵的加入速度，一般是由少到多，缓慢加入，硫酸铵尽可能磨成细粉。 温度的控制：有些酶在较高温度下稳定性能较好，可在常温下进行盐析操作，而对于大多数酶，尽可能在低温下操作。