分子生物学

4.DNA复制的起点和方向： （1）起点： ①复制慢停突变体：37℃可以正常发动DNA的复制，当转入42℃的培养条件下，由于DNA的延伸由延长基因控制，整个复制过程不会立即停止，只有当完成这一周期的复制后，下一周的复制启动不能发动，从而表现出一种复制慢停的表现。 ②复制快停突变体：在37℃和42℃下均可以正常发动DNA的复制，但当转入42℃的培养条件下，由于DNA延长基因的突变，整个复制过程表现立即停止的快停表型。 （2）方向： ①单方向复制：在一个双方向复制的环状DNA分子中，复制的起点与复制重点是分开的，如果复制叉仅向一个方向展开，则称为单方向复制。 ②双方向复制：在一个复制子内，从复制起点ori开始，DNA复制叉向两个方向展开，为双方向复制。 ③大多数原核生物DNA复制是一个起点，双方向进行的。真核生物DNA复制也是双方向进行的，但在一条染色体上有多个复制起点，即表现为多复制子。 5.DNA复制的转录激活:

DNA半不连续复制的模式说明，双链DNA分子复制起始时从复制原点处双链DNA分子解链，前导链在一段RNA 冈崎片段都需要引物的发动下按连续合成的模式完成合成过程，而后随链是按不连续合成的模式不断地完成冈崎片段的合成，而每一个冈崎片段都需要有RNA引物的发动过程。RNA聚合酶抑制剂利福平对DNA复制的起始也具有明显抑制效应。但一旦复制的其实过程完成后，利福平的抑制效应也就随之消失，表明前导链的RNA引物是由RNA聚合酶合成的，如同基因转录过程一样，RNA聚合酶可以使DNA分子局部开练，在合成10—12个核苷酸的RNA片段之后，再由DNA聚合酶完成前导链DNA的合成，在完成近1000—2000个核苷酸的DNA合成后，后随才在引发酶的作用下开始启动冈崎片段的引物RNA的合成，所以将这一过程也称为DNA复制的转录激活。

6.DAN复制体：DNA聚合酶I，DNA聚合酶III，引物的引发酶，DNA解旋酶，单链结合蛋白，连接酶在内的如此众多的酶分子均集中在复制叉处组成一个复合体协同互作，共同完成DNA分子的复制过程，这种复合体也称为复制体。 7.DNA复制的回环模式：即在复制叉处仅有一个大型的DNA复制体，后随链的一个冈崎片段模板DNA以倒退的方式从DNA聚合酶III中将模板DNA释放出来，新冈崎片段的DNA单链与前导链一样，以相同方向完成复制。以滚环模式扩增DNA的生物在复制叉处也是按回环模式完成DNA复制的。 8.线形DNA复制避免5′端短缩的方式：

共联体假说：这一假说认为在线状DNA分子的两端具有丰足末端，从而保证了合成的两条子代DNA分子在5′末端的单链缺口处互补，星辰共联体。现已证明T7噬菌体全基因组有39936bp，在编码的41个基因中，以坚定了34个基因产物，确定了26个基因的功能。复制起点位于距离端点17%处。喜爱线状DNA分子的两端具有同源性很高的167bp的正向重复序列（丰足末端），其中有一个RNaseIII切点。当两条子代DNA合成出后，随即在被切除引物RNA的缺口处互补配对形成双链，RNaseIII在切点处进行错位酶切，产生3′—OH并游离出部分单链模板。DNA聚合酶即可利用3′—OH完成5′末端缺口的补齐。

3.2真核生物DNA复制的特点

1.端粒：在染色体末端具有一种特殊的结构，它对维持染色体的稳定性起着十分重要的作用，这种结构后被称为端粒。 2.端粒酶：在1987年Greider和Blackburn从四膜虫中分离并春化懂啊相对分子质量为200000—500000与端粒序列合成有关的酶，并将其称为端粒转移酶或端粒酶。 3.真核生物的端粒酶与避免5′端短缩的机制：

端粒酶与染色体DNA末端的3′单链区域结合（5′短缩后，留下的3′游离的单链末端），端粒酶中的RNA与DNA配对，并以CCCCAA序列为模板，以DNA的3′—OH为引物，完成（CCCCTT）一个重复单位的延伸后，端粒酶沿DNA链向3′端移动，再次启动下一个重复单位的复制，如此循环复始，当一条数十次重复的cDNA端粒末端合成后，3′单链自行回折并在G—G之间以Hoogeseen配对方式连接，最后与5′端结合，不仅解决了5′端短缩问题，而且所形成的封闭式的DNA末端保证了染色体结构的稳定。

第四章RNA的转录

4.1转录的基本概念

1.转录：转录是DNA遗传信息表达的第一步。它是在RNA聚合酶的作用下，以双链DNA中的一条单链作为转录的模板，按A—U和C—C配对的原则合成RNA的过程。

4.2转录的起始

1.核心启动子：RNA聚合酶首先识别和结合-35区，所以称为-35区为RNA聚合酶的识别位点（R site），或松弛结合位点；随后RNA聚合酶活动以为到-10区，选择模板链并与之紧密结合，也称-10区为结合位点（B site），或紧密结合位点；转录起点为+1位点（I site）。分子生物学将这3个重要的位点定义为核心启动子。

2.原核RNA聚合酶：①在原核生物中，所有类型的RNA（mRNA、tRNA、rRNA）都由一种RNA聚合酶转录。 ②核心酶是由两个α亚基和一个β亚基，一个β′亚基组成，核心酶依靠静电作用力与DNA发生非专一性 与非特异性结合，负责RNA链的转录延长。 ③当核心酶与σ亚基结合就构成了RNA聚合酶的全酶，由于σ亚基的结合，使全酶的构想发生改变，全 酶依靠特定的空间结构与启动子特异的碱基序列发生专一性的结合，负责RNA转录起始。 3.增强子的结构与作用机制：

（1）增强子：是真核生物中远距离的正调控位点，通常包括组成型元件和可调节元件。 （2）增强子与启动子的区别：①增强子可以从非常远的距离使它的靶位基因转录活性增加达1000倍。②启动子只能在一个方向对邻近位置的下游基因进行转录发动，所以启动子的位置对其功能很重要。增强子没有启动子活性，但增强子的租用不依赖方向和位置，增强子可能位于基因的上游、下游甚至所调节的基因的内部，这是因为它是通过使内部DNA成环突出而实现与基本转录装 置相互作用。③增强子可以包含有功能的成簇的结合位点群，称为增强子元。他们可以调节多个启动子，在有些系统中引起增强子的竞争，增强子没有基因的特异性，即可以对增强子进行克隆，重组和转移。④增强子具有组织和细胞的特异性，这也意味着增强子的表达需要特异的蛋白因子的作用。 4.绝缘子的结构与功能：

（1）绝缘子：是一段具有特化染色质结构的区域，它能阻断增强子或沉默子对靶基因/启动子的增强或失活作用效应。而且能保护两个绝缘子之间的基因免受任何外界因子的作用与影响，形成一个特异的“真空地带”。

（2）绝缘子的功能：其一，当一个绝缘子位于增强子和启动子之间时，它可以阻断增强子与下游基本转录复合体的结合，从而消除增强子对启动子增强表达效应；其二，当一个绝缘子位于沉默子和启动子之间时，它能提供一道“屏障墙”，阻止沉默子的异染色质化区域的延伸，从而阻断沉默子对下游靶基因的失活效应。

4.5RNA的加工：

1.RNA加工：指新合成的前体RNA分子所经历的结构和化学方面的修饰与成熟过程。 2.加工的过程：

（1）RNA的5′端戴帽： ①由磷酸酶催化脱去嘌呤核苷酸的一个磷酸。 ②由鸟苷酸转移酶催化加上一个倒转的一磷酸鸟苷酸，产生一个特殊的5′,5′—磷酸二酯键。 ③由（鸟嘌呤—7）甲基转移酶催化，在G7位甲基化，产生O型帽子（Cap—0，m7GpppXpYp）,已知酵母中以O型帽子为主。 ④I型帽子：更高等的真核生物中，将进一步甲基化形成更复杂的帽子，包括在（核苷—2′）甲基转移酶催化下，在转录物中第一个残基（+1）和核糖O 位置加上甲基，产生I型帽子（Cap—0，m7GpppXpYp）。

II型帽子：如果这个位置是腺嘌呤，N 位的碱基也可能被甲基化。在有些物种中，+2位的核苷也被甲基化，产生II型帽子（Cap—2，m7GpppXmpYmp）。 （2）RNA3′端的多聚腺苷化： ①定义：真核生物成熟mRNA的3′端带有200—250个腺苷酸残基，称为多腺苷酸尾巴，具有此特征的mRNA表示为poly(A) ，不具有此特征的mRNA表示为poly(A) 。poly(A)尾巴不是由DNA编码，而是转录后在RNA末端腺苷酸转移酶的催化下，以ATP为底物添加到mRNA的3′端。在hnRNA的3′端拖尾序列中存在6个核苷酸（AAUAAA）的高度保守的加尾识别序列，或多腺苷酸化位点。 ②意义:A.参与新生RNA从DNA/RNA/RNA聚合酶II三联体复合物中的释放。B.与转录欧联既能促进转录终止，也能防止mRNA“早熟”。C.参与前提的3′端内含子的除去。D.稳定mRNA。E.影响翻译效率。 （3）RNA的剪接： ①I型内含子的结构与剪接：其内含子的特点是：A.前体RNA中内含子边界序列为5′U—G3′。B.内含子序列中含有多对内部核心序列CCS，它们两两成对反向平行，序列互补，可以形成分子内双链二级结构，以保证长的内含子能有序的折叠。C.在靠近的内含子的5′边序内，存在一段与5′供点、3′受点序列发生互补，形成二级结构的“内部引导序列”IGS，利用IGS将供点U与受点G靠近以进行剪接。 ②II型内含子的结构与剪接：内含子的结构特点是：A.边界序列为供点GUGCG......受点AU，符合Chambon Rule(即GT—AG法则)。B.在靠近内含子3′端受点上游有序列为Py Pu Py Py U A Py的7nt分支位点，在这7个核苷酸的序列中A为完全保守的碱基。 ③III型内含子结构与剪接：这种内含子的剪接主要发生在核内的前体mRNA，其边界序列的结构与II型内含子极为相似，具有供点GU......受点AG的序列结构和Py X Py U A Py7核苷酸的分支位点，其中A为转酯攻击位点，但与II型内含子的区别在于：内含子内部序列不能形成有序的二级折叠，必须由snRNA逐级组装成剪接过程。 ④反式剪接：在这种剪接方式中，被剪接的外显子来源于不同的基因，甚至不同的染色体。 ⑤选择性剪接：对内含子以及外显子进行选择性地剪接称为选择性剪接。 （4）RNA分子内的其他修饰：甲基化、脱氨、硫取代等多种修饰反应。

（5）RNA编辑：

RNA编辑有如下几种机制：一是碱基替换编辑，编辑复合体识别二级结构中某些特殊的区域，或者直接识别一段特殊的序列。一般是编辑位点周围较短的序列可以使酶识别靶位点。二是碱基插入编辑，锥虫coxIII基因的mRNA中一般以上的U在DNA中没有被编模板的插入编辑，即RNA编辑所需要的信息或者来自向导RNA，或者mRNA自身。

第五章蛋白质的翻译

5.1蛋白质合成的装备

1.合成蛋白质装置的基本组分有信使RNA（mRNA），由几种核糖体RNA(tRNA)和多种蛋白质构成的核糖体和转运RNA(tRNA)。 2.mRNA的结构和功能：

（1）结构：所有信使RNA都具有两个必须特征—一段可翻译的密码序列（ORF）和一个核糖体结合位点（RBS）：原核生物的mRNA的第一个密码子AUG上游的一个重要特征是Shine—Dalgarno序列，而真核生物mRNA除第一个密码子AUG的上游是核糖体小亚基扫描AUG的信号序列（CCACC）外，5′端非翻译区上游为帽子结构，3′端非翻译区内有多聚腺苷化的信号AAUAAA以及其校友的多聚A尾巴。

（2）功能：是蛋白质合成的模板。

（3）真核mRNA的合成与成熟都在核内，成熟的mRNA被运往胞质，作为模板翻译蛋白质，其稳定性相对较高，达几个小时。

3.tRNA的结构与功能：

（1）功能：在将密码的信息及排列转换为多肽链中的氨基酸序列的过程中起着中心及桥梁的作用。这种桥梁作用既是实体的，也是信息的，因为它们能把mRNA和多肽结合在一起，并保证多肽链的合成是按照所提供的氨基酸的顺序进行的。tRNA的这种双重功能与它的结构是统一的。 （2）结构： ①分子的5′端和3′端的7个碱基对形成氨基酸承受臂。哎计算被链接到tRNA的3′端的一个高度保守的CCA序列的腺苷酸残基的3′—OH上。 ②DHU环：即环中含有修饰碱基—二氢尿嘧啶。直接与氨基酰tRNA合成酶结合。 ③反密码子环：含有能在翻译期间与mRNA三联体密码子进行碱基配对的反密码子（第34，第35，第36位核苷酸），担负识度密码的功能。其中第34位的核苷酸表现为对密码子中的第3位核苷酸的摇摆选择配对，也称为摇摆位点。 ④额外环或可变环含有3—5个核苷酸（I类tRNA）或13—21个核苷酸（II类tRNA），用于tRNA分类。 ⑤TΨC环：该环的命名是因为环中始终含有胸腺嘧啶—假尿嘧啶—胞嘧啶的序列。其功能主要表现为与构成核糖体大亚基的5SrRNA结合，稳定蛋白质翻译装置。

5.3蛋白质的翻译

1.蛋白质翻译的若干基本概念：

（1）多顺反子:j即参与一个代谢途径的若干结构基因编码在同一个转录单位内，具有多个开放阅读框，多顺反子是原核生物操纵子的主要结构形式。

（2）阅读框：解读mRNA中遗传密码的三联体方式。

（3）开放阅读框：按一定的阅读框，从起始密码到终止密码可连续解读遗传密码的区域。 （4）反密码子：tRNA反密码子环上能与mRNA密码子互补配对的三核苷酸序列。

（5）氨酰tRNA合成酶：催化特定的氨基酸准确负载与其对应的tRNA上的专化性酶类。因此AARS具有双重重要的功能，即结合特定的氨基酸与识别对应的tRNA。

（6）起始氨基酸：蛋白质合成开始的第1个氨基酸。

（7）核糖体结合位点：位于mRNA5′端，被核糖体识别并结合的较为保守的核苷酸序列。在原核生物中该位点称为SD序列，位于起始密码上游3—10bp的位置，其保守序列为5′—AGGAGGU—3′。 2.tRNA对氨基酸的专一性负载

第六章基因表达的调控

1.基因表达：是指贮存在DNA序列中的遗传信息经过一系列步骤表现出其生物学功能的整个生物学过程。

2.管家基因：那些维持细胞的基本代谢过程所必需的、在不同的细胞类型和细胞生长时期组成型表达的基因称为管家基因。 3.奢侈基因：而为细胞分化、生物的发育以及生物适应环境所需要的基因则称之为奢侈基因，这类基因的表达表现出明显的时空调控特性。

6.1原核生物基因表达调控的理论与模式

1.乳糖操纵子的负调控诱导模型:

乳糖操纵子时典型的负调控诱导型方式。乳糖操纵子的调节基因中I基因编码一种相对分子质量为38000的多肽单体分子，4个单体分子聚合形成一个四聚体蛋白质这种四聚体蛋白质可作物阻遏物与DNA链上的操纵基因（O）序列结合，阻断了依赖DNA的RNA聚合酶与启动子序列的识别和结合，导致乳糖操纵子不能被转录。在乳糖操纵子中，阻遏蛋白是一种变构蛋白，当某种物质与之结合后就会改变蛋白会构想，使之与O基因结合的亲合力下降。而与阻遏蛋白结合的物质为异构乳糖，也称为乳糖操纵子开启诱导物。一旦它与阻遏蛋白结合，就导致构象发生改变的阻遏蛋白从操纵基因序列上解离，或使游离的阻遏蛋白的构象发生改变而不能与O基因结合。在不存在乳糖，或者乳糖与葡萄糖并存时，乳糖操纵子就一直处于关闭状态，当葡萄糖被用完，为乳糖又存在时，细菌就可开启乳糖操纵子，合成分解乳糖的相关酶，实现对环境适应的表达调控。 2.乳糖操纵子突变类型的遗传分析

（1）O基因发生突变：阻遏蛋白必须与O基因上一段特异性地DNA序列结合才能发挥作用。当O基因发生突变，使得阻遏蛋白与突变的DNA序列的结合力下降，使乳糖操纵子总是处于开放状态。表现一种组成型突变。 （2）调控基因（I）发生突变：突变型可分为两种： ①I基因发生在阻遏蛋白的DNA结合位点上，突变基因的表达产物失去与O基因的结合能力，无论乳糖是否存在，乳糖操纵子总是处于开放状态。I基因的这类突变称为组成型突变，记作I 。 ②如果I基因的突变发生在阻遏蛋白与效应物的结合位点，则突变基因的表达产物不能与效应物结合，即使存在效应物，效应物也无法与阻遏蛋白结合，不能改变阻遏蛋白的构想，被结合在O位点上的阻遏蛋白也不能被解离下来。因此，无论有无效应物，乳糖操纵子都处于关闭状态，I基因的这类突变为超阻型变异，记作I 。

（3）正常调节基因合成的阻遏蛋白能掩盖突变阻遏蛋白基因的作用，关闭乳糖代谢基因的表达；而正常操纵基因序列不能恢复突变操纵基因（ ）所控制的乳糖代谢基因的表达。因此阻遏蛋白基因突变 对正常阻遏蛋白基因 而言，表现为隐性，突变的操纵基因 对正常操纵基因 而言，表现为显性。

（4）阻遏蛋白基因突变与乳糖代谢基因其紧密连锁子对不论顺式还是反式位置关系，都是隐性的，而操纵基因突变与乳糖代谢基因在反式时是隐性的，在顺式时是显性的，所以这种显性关系也称为顺式显性，即顺式作用因子 的对与其紧密连锁基因的控制效应不受其等位基因的影响，而表现出的显性效应。

（5）阻遏蛋白基因与乳糖代谢基因是相互独立的，对细菌的乳糖代谢这一功能而言，它们不是一个作用整体。与此相反，操纵基因与乳糖代谢基因是一个作用整体，不能分割。确定位置关系时，我们利用了二倍体。实际上，细菌只有一个染色体，因此，阻遏蛋白基因与乳糖代谢基因不是一个作用整体应理解为一条DNA上两个独立发挥作用的部分；在空间上，他们可以很接近，也可以相距很远。 3.色氨酸合成酶操纵子

（1）色氨酸合成酶操纵子结构：大肠杆菌色氨酸的生物合成需要5种酶催化5步反应来完成。编码这5种酶的基因分别为紧密连锁的5个基因trpE、trpD、trpC、trpB和trpA，在基因转录过程中，这5个基因转录到一条多顺反子的mRNA上，翻译后分别编码5种酶。trpE基因是第一个被翻译的基因，与它紧邻的是启动子和操纵子基因。另外，在操纵子基因与结构基因trpE之间存在一个前导区和1个衰减子区，分别为trpL和trpa。色氨酸合成酶操纵子中的调控基因为trpR，远离5个结构基因。

（2）调节机制：trpR基因编码的产物是一种没有活性的阻遏蛋白，在没有色氨酸的情况下，trpR基因产物不能与O基因结合；当色氨酸与trpR基因产物结合后，使蛋白质的构象发生改变，从无活性的阻遏物转变成为具有结合O基因活性的阻遏物。色氨酸自身虽然不是阻遏蛋白，但起到辅助阻遏蛋白发挥功能作用。

（3）大肠杆菌色氨酸合成酶操纵子的负控制模型：当细胞中存在色氨酸是，细胞中将关闭合成酶trpE、trpD、trpC、trpB和trpA的转录，也就是说，细胞中将产生有活性的阻遏物阻抑合成相关的5种酶基因的转录。有些小分子物质与阻遏蛋白结合后可以促进阻遏蛋白与操纵基因的结合，关闭操纵子的表达。当细胞中存在色氨酸时，色氨酸分子就做诶辅阻遏物与trpR基因编码的阻遏蛋白结合，色氨酸与阻遏蛋白形成的复合体进一步与操纵子上的O基因结合，使得RNA聚合酶不能与p基因结合，导致色氨酸合成酶操纵子关闭，trpE、trpD、trpC、trpB和trpA基因不能被转录。然而，当细胞中的色氨酸被豪杰，阻遏蛋白由于没有色氨酸的结合而不再具有与O基因结合的活性，RNA多聚酶便可以与P基因结合，完成5个结构基因的转