乌榄果挥发性成分分析及其抑菌活性研究

（4）在提取液中加入过量无水硫酸钠进行干燥[14]，用分液漏斗塞入棉花过滤后得到干燥后的提取液。

（5）将干燥后的提取液倒入干净100ml圆底烧瓶置于安装好的分馏装置，60℃恒温水浴，分馏1小时，得到初步浓缩的提取液。

（6）将初步浓缩的提取液转移到10ml 圆底螺口刻度试管于氮吹仪。浓缩氮吹至1ml，过0.22 μm滤膜，得到浓缩挥发油保存至-20℃冰箱，待测。[15]

2.3.2顶空固相微萃取法（HS-SPME法）测定乌榄果肉挥发性物质

测定采用顶空固相微萃取（Headspace solid phasemicroextraction, HS-SPME）结合气质联用仪（GC-MS）。准确称取5g果肉在液氮中研磨后置20 mL萃取瓶中，加入3 mL 饱和NaCl（目的为使挥发性物质充分释放出），加入转子后加盖封口。使用手动固相微萃取进样器及65 μm 聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（PDMS/DVB）萃取头（Supelco，美国）进行吸附。萃取头在使用前按照说明书在气相色谱进样口老化2 h，老化温度为250 ℃。将老化好的萃取头插入样品瓶的顶空部分，室温下吸附30 min。吸附完成后插入GC 进样口，进行解吸附。

2.3.3 GC-MS 分析条件

GC条件

采用岛津QP-2010-Plus 气质联用仪，色谱柱为安捷伦Rtx-5MS 毛细管柱（30 m×0.5 μm×0.32mm），升温程序如下：起始温度40 ℃，保留0 min，以5℃/min 升温到180 ℃，再以10℃/min 升到250 ℃，保留2 min。进样口温度250 ℃，连接口温度280 ℃，解吸附5 min。载气为高浓度He（99.99％），不分流进样，流速为1 mL/min，吹扫流量 :3.0 mL/min。 MS条件

连接口温度250 ℃，电离方式EI，离子源温度为200 ℃，四级杆温度150 ℃；电子能量70 eV，Scan 模式全程扫描。 统计学处理

各组分质谱经NIST/WILEY 检索及资料分析，再结合相关文献、网站进行人工谱图分析以确定各化学成分，按峰面积归一化法计算其相对含量。

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2.4乌榄果挥发油抑菌活性初步鉴定

2.4.1 乌榄果挥发油乳化剂制备

取适量的乌榄果精油加乳化剂吐温-80（乳剂的1%）混匀，加少许纯水混匀制初乳后，再加纯水至所需量，混匀，备用。[16]

2.4.2菌种活化及菌悬液制备

金黄色葡萄球菌 (Staph.aureus)、大肠杆菌(B.coli)、枯草杆菌[(Ehrenberg) Cohn]、青霉菌(Penicillium sp)、黑曲霉(Aspergillus niger)(均由惠州学院微生物实验室提供)。在无菌室中，将供试菌株接种于相对应的试管斜面培养基上，细菌置于37℃恒温培养箱内培养24h；霉菌置于28℃恒温培养箱内培养48h。之后用接种环挑取少量活化菌株于装有适量生理盐水的培养皿中，用涂布器混匀，配成菌悬液备用。

2.4.3抑菌活性的测定

采用滤纸片扩散法进行提取液抑菌效果的测定[17]。用打孔器打出直径为6mm的圆滤纸片，随实验材料一起进高压蒸汽灭菌锅灭菌后备用。往培养皿中加入适量培养基，待培养基凝固后，加入50ul菌悬液，用涂布器涂布均匀。往培养皿中贴经设置浓度样液浸泡的滤纸片，每皿4片，每种菌做3次平行。以无菌水为对照，将细菌置于37℃恒温培养箱中培养24h；霉菌置于28℃恒温培养箱内培养48h.。后比较其抑菌圈大小并比较其抑菌效果。实验数据均为3次重复的平均值。

2.5数据处理

原始数据的初步统计和整理由Excel来完成的,论文相关图片经美图秀秀简单裁剪。

3结果与数据

3.1 HS-SPME法提取乌榄果挥发性成分分析

采用HS-SPME法提取的乌榄果挥发性成分的种类，从色谱图（如：图1所示）可以看出114个峰。实验结果表明：从乌榄果中共分离鉴定得到98种挥发性物质（如：表1-表7所示），其中包括38种烃类，25种醇类，7种酯类，6种酮类，2种醛类，10种芳香族类及其他类化合物。HS-SPME法提取的乌榄果挥发性成分相对含量最高的是烃类，其次是酯类，其他化合物相对含量按高到低顺序为：芳香族类>醇类>芳香类>酮类>醛类。相对含量较高的组分有：酞酸二乙酯;顺式-罗勒烯；双戊烯;1-甲基(1-甲基乙烯基)环己烯；α-水芹烯；酞酸二甲酯; 一氧化二氮；氨基甲酸铵盐；邻异丙基甲苯；α-古巴烯；β-石竹烯，各组分的相对含量按峰面积归一化法计算而得。

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3.1.1 HS-SPME法得到的色谱图

图 1HS-SPME法得到的色谱图

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3.1.2 HS-SPME法提取的乌榄果挥发性各组分名称分类

峰号 26 39 35 80 73 76 93 17 33 86 81 84 90 71 108 27 29 82

峰面积 110754118 95130177 95096576 74908619 19927737 15500939 10153595 7326951 6471005 6382026 5412926 4044869 4089624 3148944 3016667 2877167 2198774 1926594

峰面积% 11.691 10.041 10.038 7.907 2.103 1.636 1.072 0.773 0.683 0.674 0.571 0.427 0.432 0.332 0.318 0.304 0.232 0.203

分子式 C10H16 C10H16 C10H16 C10H10O4 C15H24 C15H24 C15H24 C5H12N2O C10H16 C15H24 C15H24 C15H24 C15H24 C15H24 C10H16 C10H16 C10H16 C15H24

表-1 乌榄果的挥发性成分（烃类化合物，HS-SPME法） 中文名称 英文名称 顺式-罗勒烯 双戊烯 α-水芹烯 邻苯二甲酸二乙酯 α-古巴烯 β-石竹烯 荜澄茄烯 L-丙氨酸乙烷 β-月桂烯 大根香叶烯 α-石竹烯;丁香烯 巴伦西亚橘烯 a-依兰油烯 α-荜澄茄油烯 L-水芹烯 α-蒎烯 莰烯；樟脑萜 未命名

cis-Ocimene

[18]

dl-Limonene

.ALPHA. PHELLANDRENE Dimethyl phthalate .alpha.-Copaene

TRANS(.BETA.)-CARYOPHYLLENE .delta.-Cadinene (CAS) l-Alanine ethylamide, (S)- .beta.-Myrcene Germacrene D

.alpha.-Humulene (CAS) Valencene (CAS) .alpha.-Muurolene .alpha.-Cubebene l-Phellandrene .ALPHA.-PINENE, (-)- Camphene (CAS)

1H-Cycloprop[e]azulene,

decahydro-1,1,7-trimethyl-4-methylene-, [1aR-(1a.alpha.

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