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第二章 DNA重组克隆的单元操作
练习题 噬菌体载体(练习题)
一、填空题
1．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：一是 ；二是 。 2．第一个报道的全测序的单链DNA 噬菌体是φX174，DNA 长5386 个碱基对，共 个基因，为一环状DNA 分子，基因组的最大特点是 。
3．λ噬菌体的基因组DNA 为 kb，有 多个基因。在体内，它有两种复制方式，扩增时(早期复制)按 复制，成熟包装(晚期复制)则是按 复制。它有一个复制起点，进行 向复制。λ噬菌体的DNA 既可以以线性存在又可以环状形式存在，并且能够自然成环。其原因主要是在λ噬菌体线性DNA 分子的两端各有一个 个碱基组成的天然黏性末端。这种黏性末端可以自然成环。成环后的黏性末端部位就叫做 位点。 4．根据噬菌体的包装能力，将野生型λ噬菌体的基因组DNA 改造成插入型载体，该载体的最小分子大小约为 kb，插入的外源片段最大不超过 kb。
5．野生型的M13 不适合用作基因工程载体，主要原因是 和 。 6．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自 、COS 位点序列来自 ，最大的克隆片段达到 kb。
7．有两类改造型的λ噬菌体载体，即插入型和取代型。从酶切点看，插入型为 个，取代型为 个。 8．野生型的丸噬菌体DNA 不宜作为基因工程载体，原因是：(1) (2) (3) 。 9． M13 单链噬菌体的复制分为三个阶段：(1) (2) (3) 。 10．噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA 共同构成的，其中来自质粒的主要结构是 ，而来自噬菌体的主要结构是 。
11 ．M13 单链噬菌体基因2 和基因4 之间的IG 区有三个最重要的功能，即(1) (2) (3) 。
12．野生型的M13 有10 个基因，分为三个功能集团，其中与复制有关的两个基因是： 和 。
13．以λ噬菌体载体和黏粒载体构建文库时，起始DNA 的长度是不同的，前者为 kb，后者为 kb。
14．λ噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源DNA 片段后，总的长度应在噬菌体基因 组的 的范围内。
二、判断题
1. 取代型载体(replacement vector)是指同一种限制性内切核酸酶在),DNA 中具有两个切 点，外源DNA 通过取代这两个切点间的片段被克隆。
2. 现在最常用的 pUC 载体是pUCl8,它的分子量小，具有多克隆位点和易于选择的分子标 记，并且是松弛型复制。另外，这种载体可在辅助质粒的帮助下合成单链DNA。
3. 噬菌粒(phagemid)pUCll8／pUCll9 载体是集质粒和丝状噬菌体有利特征于一身的载体， 既能合成单链DNA,又能合成双链DNA。
4. λ噬菌体 DNA 和M13 单链噬菌体DNA 在成熟前的DNA 复制都是用滚环模型。 5. M13 噬菌体每个世代裂解宿主后，可释放100 个子代噬菌体。
6. 以黏粒为载体的重组体虽然在平板上生长的速度不同，但是转化子中插入片段的扩增量
是相同的。
三、选择题(单选或多选)
1. 限制性内切核酸酶 EcoRI 在野生型的丸噬菌体DNA 中有5 个切点、Hind Ⅲ有 7 个切 点，BamH I 也有5 个切点。调整这些酶切位点的数量，主要通过( ) (a)体内突变 (b)完全酶切后连接
(c)部分酶切 (d)先用甲基化酶修饰后再酶切
2. PBluescript Ml3 载体在多克隆位点的两侧引入了T7 和T3 两个噬菌体的启动子，这样 增加了该载体的功能，如：
(a) 可以对插入到多克隆位点的外源片段进行转录分析 (b) 利用这两个启动子的通用引物进行 PCR 扩增 (c) 利用通用引物进行序列分析
(d) 利用这两个启动子进行定点突变 上述四种功能中哪一种是不正确的?( )
3. 下面关于细菌人工染色体(BAC)的特征描述，除了( C )外都是正确的。 (a) 通过电激法将大质粒转化大肠杆菌比酵母的转化率提高了 10—100 倍 (b) BAC 载体在细菌中以环形超螺旋状态存在，使分离操作起来相对容易 (c) BAC 载体在大肠杆菌宿主保持高拷贝
(d) 克隆到 BAC 载体上的外源片段可以直接进行测序以获得末端序列
4. 以黏粒为载体转染受体菌后，平板上生长的菌落会大小不一、生长速度不一的现象，其 原因是( )
(a) 营养成分不足
(b) 重组后的质粒复制不稳定
(c) 重组后的黏粒整合到宿主染色体上 (d) 重组体中插入片段的大小不同
5. M13K07 是一种辅助噬菌体DNA,可用它帮助噬菌粒制备单链DNA,这是因为( ) (a) M13K07 能够进行滚环复制，得到大量的单链噬菌体DNA (b) M13K07 能够提供成熟包装的蛋白 (c) M13K07 提供了成熟包装所需的信号 (d) M13K07 的10 个基因都是正常的
6. 黏粒(cosmid)是一种人工建造的载体，( ) (a) 它具有 COS 位点，因而可进行体外包装 (b) 它具有质粒 DNA 的复制特性 (c) 进入受体细胞后，可引起裂解反应 (d) 进入受体细胞后，可引起溶源化反应
7． Mu 噬菌体也是一种转座元件，这种转座元件( ) （a）可引起寄主的突变
（b）可用于细胞内的基因工程 （c）具有转座酶基因 （d）以上说法都正确
8． 关于 M13 的IGIX,下列说法中哪一项不妥当?( ) (a) 具有正负链的复制起点
(b) 具有噬菌体 DNA 被包装的信号 (c) 具有 150 个碱基的AT 富集区
(d) 具有八个回文序列，可形成五个发夹环
9. M13 噬菌体基因组编码10 个基因，在它的成熟过程中起调节作用的蛋白是( ) （a）gp2 蛋白 (b)gp5 蛋白 (c)gp7 蛋白 (d)gp9 蛋白
四、简答题
1．在转导过程中，通常需要把受体菌和在供体中生长的噬菌体悬浮液分别铺在选择性培养 基上，为什么?
2．如何将野生型的九噬菌体改造成为一个理想的载体?
3．用Sal I 切割从噬菌体J2 分离的DNA 时，得到8 个片段，分别是：1.3、2.8、3.6、5.3、 7.4、7.6、8.1 和11.4kb。但是，用SaI I 切割从被感染的寄主细胞中分离到的J2 噬菌体 DNA 时，只得到7 个片段，分别是:1.3、2.8、7.4、7.6、8.1、8.9 和11.4kb，根据这些 结果，您得到哪些信息?
4．在cⅠ基因正常时为什么也会出现浑浊的噬菌斑?不正常则是清亮的噬菌斑? 5．λ噬菌体DNA 被包装到噬菌体的头部，需要哪些基本条件?为什么?
五、问答题
1．为什么野生型的λ噬菌体DNA 不宜作为基因工程载体? 2．什么是蓝白斑筛选法?
3．蓝白斑筛选法为什么也会有假阳性? 4．什么是c I 筛选法?
5．λ噬菌体载体具有哪些优点与不足?
6．什么是M13 的IG 序列区?有何特点和功能?
7．将野生型的M13 改造成基因工程载体，首先是进行酶切位点的改造，请问M13 中的 EcoRⅠ最初是如何引入的？
8．以置换型λ噬菌体作为载体进行克隆时，为什么说能够形成噬菌斑的就一定是重组体？ 9．M13 系列载体具有哪些优缺点？ 10．黏粒载体具有哪些特点与不足？
11．辅助噬菌体DNA 和相应的噬菌粒是如何协同工作的？
噬菌体载体(参考答案)
一、填空题
1． 它在细菌中能够大量繁殖，这样有利于外源DNA 的扩增；对某些噬菌体(如λ噬菌体) 的遗传结构和功能研究得比较清楚，其大肠杆菌宿主系统的遗传也研究得比较详尽 2． 10；基因的重叠
3． 48．5；60；凯恩斯模型； 滚环； 双；12； COS 4． 36； 14
5． 没有合适的限制性内切核酸酶识别位点；选择标记 6． 质粒；丸噬菌体； 45 7． 1； 2
8． (1)分子量大，(2)酶的多切点，(3)无选择标记 9． (1)SS---~RF；(2)RF---~RF；(3)RF-*SS 10．复制区； IG 区
11．(1)正链复制起点； (2)负链复制起点； (3)包装信号 12． 基因Ⅱ；基因Ⅴ 13．100kb；200kb 14．75％一105％ 二、判断题
1． 错误。 不一定是同一种酶，如果两种不同的限制性内切核酸酶在载体上各只有一个 切点，两切点间的片段被取代后又不影响噬菌体的生活力，也是取代型载体。 2． 错误。 pUCl8 没有IG 区，不可能形成单链。
3． 错误。如果没有助手噬菌体的存在，则不能形成单链DNA。 4． 正确。
5． 错误。M13 噬菌体不会使宿主裂解，导致噬菌体从细胞释放出来。
6． 错误。由于重组体在乎板上生长的速度不同，转化子中插入片段的扩增量就不相同， 三、选择题(单选或多选)
1．a； 2．d； 3．c； 4．d； 5．d； 6．a，b，c； 7．d； 8．d； 9．b 四、简答题 1． 答：
这些平板起对照作用。第一个对照实验可检测和估计自发突变为野生型的频率；第二 个对照实验确证噬菌体悬液中无菌情况(即不能有任何活的供体细菌)。 2． 答：
(1)削减分子量(除去非必需区和整合区)； (2)削减酶切位点； (3)添加选择标记； (4)引入终止突变 3． 答：
(1)J2 噬菌体是一种双链线性的DNA 分子；(2)基因组全长是47．5kb；(3)进入宿主 后成环状；(4)5．3 和3．6kb 的片段分别位于线性DNA 的两端。 4． 答：
正常时，既有裂解途径也有溶源化途径。不正常则全部进入裂解途径。 5． 答：
(1)两个COS 位点；(2)线性DNA；(3)大小在丸噬菌体基因组的75％一105％的范 围之内。 五、问答题 1． 答：
(1)噬菌体DNA 没有容载能力，因为噬菌体的头部对DNA 包装的量是有限制的， 不能大于基因组的105％，所以要将λ噬菌体改造成载体，必须削减分子量。 (2)野生型的λDNA 对于一些常用的酶都有多个识别和切割位点，不便于克隆。 (3)没有可供选择的标记。
(4)野生型的λ噬菌体具有感染性，因此不够安全。 2． 答：
这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。主要是在λ载体的非必要区插入一 个带有大肠杆菌β—半乳糖苷酶的基因片段，携带有lac 基因片段的λ载体转入lac— 的宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳糖苷(X-gal)平板上形成浅 蓝色的噬菌斑。外源基因插入lac(或lac 基因部分被取代)后，重组的噬菌体将丧失分解 X-gal 的能力，转人lac—的宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳 糖苷(X-gal)平板上形成白色的噬菌斑，非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。 3． 答：
β—半乳糖苷酶的N 末端是非必需的，可以进行修饰，并不影响酶的活性或。肽的互 补性。如果插入的外源DNA 引起。肽的可读框的改变，或者插入片段在正确的可读框 中含有终止密码的话，就会形成白色噬菌斑。如果插入DNA 的碱基数正好是3 的倍数， 或者插入的DNA 中不含有终止密码的话，仍然会形成蓝色噬菌斑。这种插人物的长度
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