分子生物学基因工程实验讲义

徐州工程学院

《分子生物学与基因工程实验》自编讲义

发布时间： 2011-11-18 11:00:00

编写：高兆建

2010

年10月

目 录

实验一 细菌基因组提取

实验二 目的基因的克隆 实验三 质粒载体的制备

实验四 基因及质粒载体的酶切及鉴定 实验五 大肠杆菌感受态细胞的制备

实验六 目的基因同载体的连接、转化及鉴定

实验一 细菌基因组提取

一、实验目的

1.学习并掌握细菌基因组的提取方法 二、实验原理

DNA是一个环形的大分子DNA,真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内。不同种属的生物，以及不同形式的细胞（如菌类、培养细胞、植物组织，动物组织）基因组提取的方法是不同的，但其基本原则是类似的，即既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。SDS的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价

键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。 三、实验材料

大肠杆菌DH5α菌液

三、实验试剂

LB液体培养基，TE溶液，10%SDS，蛋白酶K，5mol/L NaCl， CTAB/NaCl溶液，酚/氯仿/

异戊醇，异丙醇，70%乙醇 四、实验仪器与用具

微量移液器，低温离心机，水浴锅，eppendorf管，恒温摇床 五、实验步骤

（1）将2mL培养至对数期的大肠杆菌DH5α菌液5000rpm冷冻离心10min弃上清；

（2）加190μL TE悬浮沉淀，并加10μL 10%SDS，1μL 20mg/mL蛋白酶K，混匀，37℃保温1h；

（3）加30μL 5mol/L NaCl，混匀；

（4）加30μL CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20min；

（5）加入300μL酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提，5000rpm离心10min，将上清液移至干净离心管；

（6）加入300μL氯仿/异戊醇（24：1）抽提，取上清液移至干净管中； （7）加300μL异丙醇，颠倒混合，室温下静止10min，沉淀DNA；

（8）5000rpm离心10min，沉淀DNA，加入500μL70%乙醇，5000rpm离心10min，弃乙醇，吸干；

（9）溶解于20μLTE，取3μL 用于琼脂糖凝胶电泳验证，其余-20℃保存。 思考题：

1. 2.

细菌菌体破碎的原理是什么？ 提取过程中如何去除多糖？

实验二目的基因的克隆 ——多聚酶链式反应(PCR)

一、实验目的

通过本实验学习PCR反应的基本原理，掌握PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。 二、实验原理

PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。基本原理及过程如下：

PCR循环过程中有三种不同的事件发生：（1）模板变性；（2）引物退火；（3）热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。

1．变性：加热使模板DNA在高温下（94-95℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。

2．退火：在体系温度降至37-65℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA，即退火阶段。

3． 延伸：体系反应温度升至中温72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5’到3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。

上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。

典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。

琼脂糖凝胶电泳的原理：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率

就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5 ng以上的DNA。 三、实验材料及相关试剂

基因组DNA，基因特异性引物，PCR扩增相关试剂 等 四、实验步骤

1．模板DNA的抽提：实验一所得的水稻基因组DNA。 2．PCR操作 (在冰上操作)：

（1）PCR反应混合液的配制：反应体系25 μL, 在无菌的0.2 mL离心管中按下列操作程序加样：

以质粒或提取的基因组为模板，按顺序加入以下试剂，建立20μl PCR反应体系：

试剂（Reagent）

ddH2O 10 × PCR buffer

dNTP Mix (2.5 mmol/L each)

cDNA

上游引物（10 μM） 下游引物 (10 μM) Taq DNA polymerase (5 U/μl)

Total

体积（Volume，μl）

13.0 2 2 2 1 1 0.5 20

（2）将反应混合液混匀, 然后每个PCR管中分装24 μL反应混合液，再加1 μL模板DNA，最后加1滴石蜡油，防止水分蒸发, 然后稍离心。

（3）将PCR管放到PCR热循环仪中，按下列程序开始循环：

94℃ 4 min (预变性) 94℃ 30 sec, 60℃ 30 sec, 72℃ 2 min 72℃ 7 min

35个循环

（4）注意事项

由于PCR灵敏度非常高，所以应当采取措施以防反应混合物受痕量DNA的污染。