实验步骤方法

b 组织中含过氧化物酶未阻断 可再配置新鲜3% H2O2封闭孵育时间延长 c 组织中含内原性生物素 正常非免疫动物血清再封闭 d 血清蛋白封闭不充分 延长血清蛋白封闭时间 3、染色弱

a 抗体浓度过低、孵育时间过短 提高抗体浓度、孵育时间不能少于60分钟 b 试剂超过有效使用时间 应更换试剂

c 操作中添加试剂时缓冲液未沥干 每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液 使试剂稀释 （应防止切片干燥）

d 室温太低 低于15度 要改放在37度孵育箱孵育30-60分钟或4 度冰箱过夜 e 蛋白封闭过度 封闭不要超过12分钟 4、染色阴性

a 操作步骤错误 应重试 设阳性对照

b 组织中无抗原 设阳性对照以验证试验结果

c 一抗与二抗种属连接错误 仔细确定一抗二抗种属无误。

免疫荧光 细胞荧光：

1. 种植细胞到小圆片上，37 ℃孵育过夜 2. 刺激细胞

3. 固定：到达合适时间的细胞孔，弃掉原来的培养基，细胞用PBS洗一下，加入4%多聚甲醛固定，每孔300 μL，室温40 min或4 ℃ 1 h，PBS洗，10分3次

4. 封闭：将小圆片挑出放到湿盒上，滴上封闭液，每片40 μL，室温2 h。（膜定位的分子封闭液里面不用加triton X-100）

5. 一抗：封闭结束后，用滤纸在边缘吸掉封闭液，直接滴加一抗，用1% BSA稀释，室温2 h，然后4 ℃过夜 6. 复温0.5 h，PBS洗，5分3次

7. 二抗：避光加入荧光二抗（1:1000），用PBS稀释，4 ℃孵育2 h，PBS洗，5分钟3次

8. 染核：Hochest或DAPI，用PBS稀释，可以和二抗一起加，1:1000，PBS洗，10分3次（也可以单独加，1:800，室温20min）

9. 封片：避光条件下，在载玻片上滴封片液，每个小圆片6 μL，将小圆片倒扣在封闭液上，注意不要产生气泡。 试剂配制： 细胞用PBS

NaCl 8.00 g KCl 0.20 g Na2HPO4·12H2O 1.44 g KH2PO4 0.24 g ddH2O 至1000 ml

4% 多聚甲醛：多聚甲醛：PBS=1g：100 ml，按比例称取后，于电炉上加热，待

溶解后，室温冷却后定容，然后定容，置于4度保存

封片液：丙三醇：PBS=1:1

组织荧光 1. 冰冻切片放在37 ℃烘烤1 h，石蜡切片先脱蜡、水化、抗原修复，然后置于PBS中浸泡

2. 涂指甲油，封闭液室温封闭2 h

3. 一抗：封闭结束后，甩掉多余的封闭液，直接滴加一抗，用1% BSA稀释，室温2 h，然后4 ℃过夜

4. 二抗：避光加入荧光二抗（1:1000），用PBS稀释，4℃孵育2h，PBS洗，5分3次

5. 染核：Hochest或DAPI，用PBS稀释，1:800，室温20min，PBS洗，10分3次（也可以和二抗一起加，1:1000）

6. 封片：避光条件下，在载玻片上滴封片液，每个玻片20 μL，将小圆片倒扣在封闭液上，注意不要产生气泡 试剂配制：

1% triton X-100：triton X：PBS=1ml：100 ml 1% BSA：BSA：PBS=1g：100 ml 细胞用PBS：NaCl 8g KCl 0.2 g NaHPO4 1.44 g KH2PO4 0.24 g ddH2O 1000 ml

可溶形式GST融合蛋白的亲和纯化 试剂：

Lysis buffer (pH 7.5) 1 L Tris (50 mmol/L) 6.057 g NaCl (200 mmol/L) 11.688 g DTT(2mmol/L) HCl调节pH 至7.5 GST Elution Buffer 50mM Tris-HCl (pH 8.0) 10mM Glutathione 实验步骤：

1) 在50 ml离心管中加入适量lysis buffer（每克菌体加入2~5 ml lysis buffer，故需先初步估计菌体质量）。

2) 加入终浓度为1 mg/ml的溶菌酶，冰上放置裂解30 min。 3) 冰浴超声破碎菌体（工作3秒/冷却6秒/200W 60次）。12,000 rpm离心20-30 min，收集上清液，以0.45μm滤膜过滤样品。 4) 轻混Glutathione Sepharose 4B 树脂，使其与保存液混匀呈完全悬浮状态。吸取一定量树脂（1ml沉积的树脂可纯化5mg目的蛋白质）悬液加到聚丙烯柱内，使树脂在重力作用下沉积。

5) 以5倍柱体积的PBS (138mM NaCl , 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4）

洗柱。

6) 上样，使样品靠重力缓慢流过柱子。 7) 以10倍柱体积PBS淋洗。

8) 加入1倍柱体积的 GST Elution Buffer(50mM Tris-HCl (pH 8.0), 10mM Glutathione)，室温孵育10 min后，收集流出液，其中含有被纯化蛋白质。 9) 重复洗脱一次，纯化后的蛋白取少量进行SDS-PAGE鉴定，剩余蛋白-80℃保存。

10)以5倍柱体积的PBS洗柱，再生柱子。

第二节 免疫共沉淀

1、细胞予预冷的0.01MPBS洗涤2次；

2、加入1ml PBS后，细胞刮冰上刮取细胞，移至1.5ml离心管中，1000g×5min离心收集细胞； 3、加入配置好的500μl细胞裂解液置于轮转仪上4℃轮转30min彻底裂解细胞，12000g 4℃离心10min，将上清液转移至新EP管。

4、预澄清 加入20μl 混匀的Protein A/G beads，在DNA混合仪上转动1小时，900g 离心5min(4℃)，将上清液转移至新离心管，弃珠子。

5、取40-60μl上清液作为Input，加入等量2×SDS loading buffer，沸水煮5-10min，离心后冻存。其余部分平分为两等分，分别加入等量（1μg）Normal IgG 或相应抗体, 在DNA混合仪上转动2小时（4℃）。

6、在每个离心管中各加入30μl 混匀的Protein A/G beads 继续转动2小时。然后900g 离心5min（4℃），弃上清。

7、加入1ml洗涤缓冲液洗涤珠子。900g离心5min（4℃），共洗涤3次。

最后将40-60μl 2×SDS loading buffer加入洗好的珠子中，沸水煮5-10min，离心后冻存。 8、连同Input样品一起进行Western blot检测。

裂解缓冲液的配制：

50 mM Tris-HCl (pH 7.5) 150 mM NaCl 5 mM EDTA (pH 8.0)

5 mM EGTA 15 mM MgCl2 1% Nonidet P-40 临用前加入： 1 mM Na3VO4

25 g/ml phenylmethylsulfonyl fluoride （PMSF） 1 mM β-glycerophosphate 1× protease inhibitor cocktail

洗涤缓冲液可直接用裂解液母液。

第三章 细胞生物学实验

第一节 细胞培养

一、细胞培养的注意事项

细胞培养在细胞房内进行，需严格遵守细胞房操作守则操作。特别指出的是：

1、细胞房为细胞培养操作专用，不得在细胞房内进行非细胞培养操作。凡是需要在细胞房培养细胞均需经过允许，并登记备案。

2、在细胞房培养细胞者严格按照其分配的位置摆放细胞培养物品、细胞及培养试剂，并在规定的操作台使用。严禁在未告知对方的情况下随意使用他人的培养基、细胞器材！

3、在本细胞房培养细胞者进门时需要更换拖鞋、必须穿白大褂和戴手套（进行细胞操作必须佩带乳胶手套），操作之前，必须用酒精喷壶喷洒双手，保证双手均进行过消毒。每次操作前请用紫外照射台面，并擦拭台面。培养瓶进入培养箱前需要清洁其表面。如发生培养瓶内培养基漏出，立即用酒精棉将瓶外表面及箱内污迹擦拭干净。

4、细胞操作完成之后，要清理台面上任何遗留的东西，包括枪头盒、滴管、手套和用完的培养皿等。废液缸内的废液、枪头和滴管需要及时清理，再放回超净工作台内。

5、细胞房值日的同学每天清理细胞房，每周四打扫细胞房一次（包括垃圾清理和拖地），并且配制75%的酒精及灌装95%的酒精。及时补充培养箱内无菌蒸馏水并应注意CO2浓度，发现问题及时报告。

6、细胞培养箱需要每月25号进行消毒。培养细胞一经污染，需要及时汇报，寻找污染原因，并及时清理污染的培养箱和培养基。

二、细胞培养常用试剂的配制

1、0.01mM PBS：NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4 1.44 g，KH2PO4 0.24 g，H2O 800 ml，搅拌溶解，定容至1 000 ml，高压灭菌后4 ℃保存。

2、D-Hank’s液：NaCl 80.0 g，Na2HPO4 0.6 g，KCl 4.0 g，KH2PO4 0.6 g，H2O 800 ml，搅拌溶解，定容至1 000 ml，高压灭菌后4 ℃保存。

3、青霉素-链霉素储存液：青霉素40万U（5瓶）、链霉素4g（4瓶），H2O 400 ml，搅拌溶解，过滤灭菌后分装，-20℃保存。使用时1:1000稀释，终浓度为100 U/ml青霉素和100 μg /ml链霉素

4、0.25%胰酶：胰酶0.25g，D-Hank’s液 100ml，搅拌溶解，过滤灭菌后4 ℃保存。 5、DMEM基础培养基：DMEM干粉1瓶，NaHCO3 3.7g，HEPES 2.73g，H2O 800 ml，搅拌