超临界CO2萃取关黄柏中挥发油的工艺研究及其成分的GC-MS分析

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在对挥发油成分分析时，有荧光分析法、高效液相色谱法、紫外分光光度法、气相色谱法、质谱法、GC-MS（气质联用）分析法等。应用GC-MS分析法较其他方几种方法有优势，可以使样品的分离、鉴定、定量一次完成，其对中药成分分析的发展起到促进作用，故选用GC-MS分析法对超临界CO2萃取得到的挥发性成分进行分析，先将GC-MS分析的相关知识介绍如下。

气相色谱和质谱概念：气相色谱是一种以气体为流动相的柱色谱法，根据所用固定相状态的不同可分为气-固色谱(GSC)和气-液色谱(GLC)。质谱分析法是通过对被测样品离子的质荷比的测定来进行分析的一种分析方法。被分析的样品首先要离子化，然后利用不同离子在电场或磁场的运动行为的不同，把离子按质荷比（m/z）分开而得到质谱，通过样品的质谱和相关信息，可以得到样品的定性定量结果。

气相色谱和质谱原理：气相色谱的流动相为惰性气体，气-固色谱法中以表面积大且具有一定活性的吸附剂作为固定相。当多组分的混合样品进入色谱柱后，由于吸附剂对每个组分的吸附力不同，经过一定时间后，各组分在色谱柱中的运行速度也就不同。吸附力弱的组分容易被解吸下来，最先离开色谱柱进入检测器，而吸附力最强的组分最不容易被解吸下来，因此最后离开色谱柱。如此，各组分得以在色谱柱中彼此分离，顺序进入检测器中被检测、记录下来。气相色谱把化合物分离开，然后用质谱把分子打碎成碎片，来测定该分子的分子量。质谱法应用电子流轰击、化学电离、强电场作用、大气压离子化等多种离子化技术，使物质分子失去外层价电子形成分子离子，若获得的能量超过其离子化所需的能量时，分子离子中的某些化学键可能继续发生断裂而形成不同质量的碎片离子，一般选择其中带正电荷的离子进入质量分析器，使其在电场或磁场的作用下根据其质荷比（m/z，离子质量与电荷之比）的差异进行分离。按各离子m/z的顺序对离子相对强度大小记录，所得图谱即为质谱图。

气相色谱法分析具有以下特点：(1)气相色谱法是指用气体作为流动相的色谱法，由于样品在气相中传递速度快，因此样品组分在流动相和固定相之间可以瞬间地达到平衡；(2)可选作固定相的物质很多，因此气相色谱法是一个分析速度快和分离效率高的分离分析方法；(3)近年来采用高灵敏选择性检测器，使得它又具有分析灵敏度高、应用范围广等优点。

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质谱分析具有以下一些特点:(1)可以对气体、液体、固体等进行分析,分析的范围比较广;(2)可以测定化合物的分子量,推测分子式、结构式,用途广;(3)分析速度快,灵敏度高,样品用量小,只需要1mg左右,有时只要几个微克就可以了。

质谱仪：质谱仪主要组成部分有高真空系统、样品导入系统、离子源、质量分析器、离子检测器及记录装置。质谱仪的进样系统、离子源、质量分析器、检测器等主要部件需要在真空状态下工作，其目的是为了避免离子散射以及离子与残余气体分子碰撞引起能量变化，同时也可降低本底和记忆效应；被分析物质能否被离子化并获得一定能量，进而被打为分子离子，主要在于离子源；分子离子能被分析并检测出来主要在于质量分析器和离子检测器，所以高真空系统、离子源、质量分析器和离子检测器是仪器的核心。

挥发油具有抗过敏、酶抑制、抗炎、抗突变、抗癌、抗微生物、抗病毒、驱虫、抗氧化和对中枢神经系统的镇静作用等药理活性并在医学方面具有多种用途，可以制成祛痰药、止咳平喘药、驱虫药、抗癌药等，还可以应用于化妆品产业，因此，为了综合开发利用黄柏资源，发展一药多用的开发模式，我们对产自黑龙江和吉林山区的黄柏的挥发性成分进行了研究，鉴于超临界CO2流体萃取技术具有纯度高、杂质少、提取率高、操作方便无需溶剂等优势，故采用超临界CO2萃取技术萃取关黄柏中挥发性成分，并确定最佳的提取工艺条件，采用气相色谱-质谱联用技术对其挥发油成分进行分析，应用邻苯三酚自氧化体系研究挥发油的体外抗氧化活性。

1 仪器、材料和试剂

1.1 主要仪器

HA 221-55-06型超临界CO2萃取装置 烘干机

FA 2004型电子天平 微型植物粉碎机 婴儿秤

江苏南通华安超临界萃取有限公司 巩义市予华仪器有限责任公司 上海恒平科学仪器有限公司 天津市泰斯特仪器有限公司 黑龙集团恒器厂

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UV 757型紫外分光光度计 7890 A气相色谱仪 5975 C质谱仪

上海精密仪器有限公司制造 美国安捷伦公司 美国安捷伦公司

1.2 试剂

二氧化碳（食品级） 20110316 20091121 无水乙醇 20090427 正己烷（色谱纯） 20090526 三（羟甲基）氨基甲烷（邻苯三酚）

20090325 盐酸

佳木斯市气体化有限公司 天津市凯通化学试剂有限公司 天津市光夏京西化工研究所 天津市凯通化学试剂有限公司 天津市凯通化学试剂有限公司

1.3 实验材料

黄柏，产自黑龙江和吉林山区，经安国市药材公司炮制成中药饮片，为关黄柏，购自黑龙江省佳木斯市民生药行。将黄柏饮片用烘干机烘干，用微型植物粉碎机将黄柏饮片粉碎到20目，备用。

2试验方法

2.1 超临界CO2萃取关黄柏挥发性成分的工艺研究

2.1.1单因素试验

2.1.1.1萃取压力（p）对提取率的影响

将粉碎并称好的160 g黄柏药粉装入萃取罐，并按顺序放入金属垫片、螺丝扣、皮环，将萃取罐装入仪器中萃取釜Ⅱ的位置，开启加热系统对萃取釜Ⅱ和分离釜Ⅰ、Ⅱ进行加热，并启动制冷系统。关闭萃取釜两端阀门6和7，开启阀门11，排空气数秒。当萃取釜和分离釜储罐的温度均达到实验预热温度时，开启CO2气瓶阀门，CO2首先经制冷系统冷凝后，通过高压泵送入萃取釜Ⅱ和两个分离釜中。当萃取时间、萃取温度恒定，而萃取釜Ⅱ的压力分别达到10 Mpa（15 Mpa、20 Mpa、25 Mpa、30 Mpa）[1]时，两个分离釜的压力分别达到5 Mpa和10 Mpa时，开始计时萃取，并每隔30 min从分离釜Ⅰ和分离釜Ⅱ放料[2]，并

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称重。

2.1.1.2萃取温度（T）对提取率的影响

将粉碎并称好的160 g黄柏药粉装入萃取罐，并按顺序放入金属垫片、螺丝扣、皮环，将萃取罐装入仪器中萃取釜Ⅱ的位置，开启加热系统对萃取釜Ⅱ和分离釜Ⅰ、Ⅱ进行加热，并启动制冷系统。关闭萃取釜两端阀门6和7，开启阀门11排空气数秒。当萃取釜Ⅱ的温

[2]度达到35℃（40℃、45℃、50℃、55℃），分离釜储罐的温度分别达到30℃与40℃（35℃

与45℃、40℃与45℃、45℃与55℃、50℃与55℃）时，开启CO2气瓶阀门，按照2.1.1.1的试验方法进行操作。

2.1.1.3萃取时间（t）对提取率的影响

实验方法同2.1.1.1的方法，萃取过程中，在萃取釜Ⅱ的压力20 Mpa、温度35℃恒定条件下，分别萃取40 min、60 min、80 min、100 min、120 min[2]时放料，并称重。

2.1.2 正交实验

据以上单因素实验数据列出正交试验表，考查萃取压力（p）、萃取温度（T）、萃取时间（t）三个因素对提取率的综合影响。 2.1.2.1正交试验的因素水平表。

因素水平表[3-4]（见表1）

表1 因素水平表

因 水 素 平 1 2 3

10 20 30

35 45 55

40 80 120

压力Mpa 温度℃ 时间min 2.1.2.2列出正交实验表，应用表L9（34）列出正交表。

正交试验表[5-11]（见表2）

表2 正交实验表

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