组织培养在种质资源保存中的应用 - 图文

所谓低温保存法就是将种质用离体培养的方式储存在非冻结程度的低温下（1—9℃），但热带亚热带植物在10—20℃也能延缓其生长。 Mullin和schlegel（1976）在4℃的黑暗下将离体培养的50多个草莓品种的茎培养物保持其生活力长达6年之久，期间只需每几个月加入新鲜的培养液。葡萄和草莓茎尖培养物分别在9℃和4℃下连续保存多年，每年仅需继代一次。Lundergan等（1979）将苹果茎尖培养物在1—4℃下储存12个月，仍未失去其生长、再生的能力，移至常温下（26℃）下，这些材料均能再生植株。梨试管苗在4℃下，每2年继代一次，保存后，材料田间生长正常（Wanas,1986）。猕猴桃茎尖培养物在8℃，黑暗条件下保存3年后，全部存活，且能产生很多茎尖（Monette等，1986）。芋头茎尖培养物在9℃，黑暗条件下保存3年，仍有100%的存活率（Staritshy,1986）.在1℃按条件下，西洋梨和砂梨品种茎尖离体保存12个月后存活率超过60%;而主产日本的砂梨品种储存20个月后存活率几乎达100%，再生良好（Moriguchi等1990）。5℃下保存的Senryo梨和西洋梨品种Whinter Nelis茎尖分生组织，64周后存活率几乎100%（而0℃下保存4周后死亡）。这种保存方式已在200多个日本梨品种中应用（Oka等，1997）。何善强将草莓愈伤组织保存在-20℃、-40℃和-70℃的温度中，再生良好，且发现快速递级冰冻效果较好。

应当指出的是，在低温保存植物培养过程中，正确选择适宜低温是保存后高存活率的关键。大量实验研究表明，不同植物不同基因型对低温的敏感性也不一样。植物对低温的耐受性不仅取决于基因型，

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而且与其生长和习性有关。通常认为，温带植物宜在0—6℃下保存，而热带植物最适低温为10—15℃。 （三）高渗透压保存法

高渗透压保存法就是通过提高培养基的渗透压，达到抑制培养物生长速度的保存方法。这种方法主要是通过影响离体培养物的吸收作用而减缓培养物的生长。一般来说，离体培养物正常生长所使用的培养基蔗糖浓度为2％～4％，提高蔗糖浓度到10％左右，就可达到抑制培养物生长的目的。

提高培养基的渗透压还可采用外加甘露醇、山梨醇等惰性物质(不易被培养物吸收)来提高渗透压，这样可以使其限制离体培养物生长的作用维持更久。一般可用2％～3％蔗糖加2％～5％的甘露醇处理。如在马铃薯外植体的培养基上加入8％蔗糖或3％甘露醇，均可降低培养物生长速度，延长继代培养间隔期。但要注意渗透压太高可能导致培养物死亡。此外，还可以通过增加培养基中琼脂的用量来提高渗透压。

（四）生长抑制剂(或延缓剂)保存法

常规组织培养的培养基中，通常是附加生长素或细胞分裂素，以促进外植体生长与发育。但在离体种质资源保存中，则通常采用添加外源生长抑制剂(或延缓剂)来延缓培养物的生长。最常用的是天然生长抑制剂—ABA，具有抗赤霉素的作用，阻碍RNA聚合酶的活性，抑制DNA合成，从而达到抑制外植体生长的目的。此外，常用的还有青鲜素、矮壮素、二甲氨基琥珀酸酰胺(B9)、多效唑等人工合成的植物

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生长抑制剂。

（五）降低氧分压保存法

通过降低培养容器内的氧分压，改变培养环境的气体状况，能抑制离体培养物细胞的生理活性，延缓衰老，从而达到离体保存种质的目的，其原理类似于果蔬类的贮藏保鲜方法。如果培养容器内的氧分压太低，则会产生毒害作用。 （六）干燥保存法

水是生命活动的基质，降低培养物水分，其生命活动就能延缓，这与传统的种子干燥贮存类似。如对胡萝卜体细胞胚、愈伤组织进行脱水处理(将离体材料放在滤纸上，置于空气流动的无菌箱中风干4～7d)，然后置于加生长延缓剂或限制蔗糖的条件下保存。在不含蔗糖而其他条件正常的培养基上可以保存2年。

利用限制生长方法进行植物无性系的离体保存，简便易行，材料恢复生长快，适于现代化种质库的管理。值得一提的是，离体保存植物种质时，不同植物、不同基因型或同一品种的不同材料，所采用的保存方法也大不相同。具体采用哪种保存方法，可能与品种的特性和基因型有关。在离体种质保存的实际操作中，通常是把两种或两种以上的保存方法结合使用，更有助于延长不同植物的保存年限。 三、超低温保存种质保存 （一） 超低温保存的概念

20世纪70年代，Nay和Street首先证明植物悬浮培养细胞在液氮中保存后能恢复生长，从而导致了种质资源超低温保存法的发

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展。植物超低温种质保存是指将植物的离体材料包括茎尖(芽)、分生组织、胚胎、花粉、愈伤组织、悬浮细胞、原生质体等，经过一定的方法处理后在超低温(一196℃液氮)条件下进行保存的方法。目前，采用超低温保存植物离体种质获得成功的有草莓茎尖、苹果冬眠芽、香蕉茎尖、猕猴桃茎尖、薯蓣茎尖、马铃薯茎尖、苹果根尖、甘薯茎尖等。

（二）超低温保存的原理

将要保存的离体种质经过一定方法进行处理，然后将其保存在液氮中(－196℃)。在液氮中几乎所有的细胞代谢活动、生长都停止了，因而排除了遗传性状的变异，同时保存了细胞的活力和形态发生潜能。

低温冰冻过程中，如果生物细胞内水分结冰，细胞结构就会遭到不可逆的破坏，导致细胞和组织死亡。植物材料在超低温条件下之所以可以长期保存并能在离开保存环境后正常进行细胞分裂和分化，就是在冰冻过程中避免了细胞内水分结冰，并且在解冻过程中防止细胞内水分的次生结冰而达到植物材料保存目的。但是，植物细胞含水量比动物细胞高，在冷冻(freezing)过程中，会有冰晶形成和过度脱水，在解冻(thawing)过程中也会重新形成冰晶和遭受温度冲击(thermal shock)，保存难度大。如果直接将保存材料投放到液氮中，细胞和组织由于细胞内水分结冰，引起组织和细胞死亡。因此，植物种质超低温保存必须采取如下措施：①选择细胞内自由水少、抗冻能力强的植物材料；②采取一些预处理措施，提高植物材料的抗冻能力；③在冷

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