激素测定操作步骤

植物激素的酶联免疫吸附测定法（ELISA）---小麦

材料、试剂及设备

1 材料

各种新鲜植物材料 2 仪器设备

研钵，冷冻离心机，台式快速离心浓缩干燥器或氮气吹干装置，酶联免疫分光光度计，吸水纸，恒温箱，冰箱，酶标板（40孔或96孔），可调微量液体加样器（10μl，40μl,200μl,1000μl），带盖瓷盘（内铺湿纱布）。 3 试剂

(1) 磷酸盐缓冲液（PBS）：称取8.0g NaCl, 0.2g KH2PO4 , 2.96g Na2HPO4 ·12H2O，用量筒加1 000 ml蒸馏水，pH为7.5。

(2) 样品稀释液：500 ml PBS中加0.5 ml Tween-20，0.5g明胶（稍加热溶解）。 (3) 底物缓冲液：称取5.10g C6H8O7·H2O（柠檬酸）， 18.43g Na2HPO4·12H2O，用量筒加1 000ml蒸馏水，再加1 ml Tween-20，pH为5.0。

(4) 洗涤液：1000ml PBS加1mlTween-20。 (5) 终止液：2mol/L H2SO4。

（6）提取液：80％甲醇，内含1 mmol/L BHT(二叔丁基对甲苯酚，为抗氧化剂，先用甲醇溶解BHT，再配成80%的浓度))。

操作步骤

1．样品中激素的提取

（1） 称取0.5g左右新鲜植物材料，加2ml样品提取液，在冰浴下研磨成匀浆，转入10ml离心管，再用3ml提取液分次将研钵冲洗干净，一并转入试管中，摇匀后放置在4℃冰箱中。 （2） 4℃下过夜提取，3500转/min离心8min, 取上清液，残渣弃去。

（3） 上清液过C-18固相萃取柱。具体步骤是： 80%甲醇（1ml）平衡柱→上样→收集样品→移开样品后用100%甲醇（5ml）洗柱→100%乙醚（5ml）洗柱→100%甲醇（5ml）洗柱→循环。

（4） 将过柱后的样品转入25ml小烧杯中，真空浓缩干燥或用氮气吹干，除去提取液中的甲醇，用1ml样品稀释液定容。

2．样品测定（本指南所用的量是按一块96孔板计算的） 竞争：即加标准物、待测样和抗体。

加标样及待测样： 取适量所给标样稀释配成： ABA， ZR标准曲线的最大浓度为100ng/ml,然后再依次2倍稀释8个浓度（包括2个0ng/ml，加入前两行的最后两排 ）。将系列标准样加入96孔酶标板的前两行，每个浓度加2孔，每孔50μl,其余孔加待测样，每个样品重复3孔，每孔50μl。

加抗体：在5ml样品稀释液中加入一定量的抗体（最适稀释倍数见试剂盒标签,如稀释倍数是1：2000，就要加2.5μl的抗体）,混匀后每孔加50μl，然后将酶标板加入湿盒内开始竞争。

竞争条件37℃左右0.5h。

洗板：将反应液甩干并在报纸上拍净。第一次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着加第二次。共洗涤四次。

加二抗：将适当的酶标二抗，加入10ml样品稀释液中（比如稀释倍数1:1000就加10μl），混匀后，在酶标板每孔加100μl，然后将其放入湿盒内，置37℃下，温育0.5h。 洗板：方法同竞争之后的洗板。

加底物显色：称取15mg左右邻苯二胺（OPD）溶于10ml底物缓冲液中（小心勿用手接触OPD），完全溶解后加4μl 30% H202。混匀，在每孔中加100μl，然后放入湿盒内，当显色适当后（肉眼能看出标准曲线有颜色梯度，且100ng/ml孔颜色还较浅），每孔加入50μl 2mol/L硫酸终止反应。

比色：在酶联免疫分光光度计上依次测定标准物各浓度和各样品490nm处的OD值。