生物样品定量分析方法验证指导原则

（三）校正范围

如果在试验样品分析开始前，已知或预期试验样品中的分析物浓度范围窄，则推荐缩窄标准曲线范围，调整质控样品浓度，或者适当加入质控样品新的浓度，以充分反映试验样品的浓度。

如果看起来很多试验样品的分析物浓度高于定量上限，在可能的情况下，应该延伸标准曲线的范围，加入额外浓度的质控样品或改变其浓度。

至少2个质控样品浓度应该落在试验样品的浓度范围内。如果标准曲线范围被改变，则生物分析方法应被重新验证（部分验证），以确认响应函数并保证准确度和精密度。 （四）试验样品的重新分析和报告值选择

应该在试验计划或标准操作规程中预先确定重新分析试验样品的理由以及选择报告值的标准。在试验报告中应该提供重新分析的样品数目以及占样品总数的比例。 重新分析试验样品可能基于下列理由： ·由于校正标样或质控样品的准确度或精密度不符合接受标准，导致一个分析批被拒绝； ·内标的响应与校正标样和质控样品的内标响应差异显著； ·进样不当或仪器功能异常； ·测得的浓度髙于定量上限，或低于该分析批的定量下限，且该批的最低浓度标样从标准曲线中被拒绝，导致比其他分析批的定量下限高； ·在给药前样品或安慰剂样品中测得可定量的分析物； ·色谱不佳。

对于生物等效性试验，通常不能接受由于药动学理由重新分析试验样品。 在由于给药前样品阳性结果或者由于药动学原因进行重新分析的情况下，应该提供重新分析样品的身份、初始值、重新分析的理由、重新分析获得值、最终接受值以及接受理由。 在仪器故障的情况下，如果已经在方法验证时证明了重新进样的重现性和进样器内稳定性，则可以将已经处理的样品重新进样。但对于拒绝的分析批，则需要重新处理样品。 （五）色谱积分

应在标准操作规程中描述色谱的积分以及重新积分。任何对该标准操作规程的偏离都应在分析报告中讨论。实验室应该记录色谱积分参数，在重新积分的情况下，记录原始和最终的积分数据，并在要求时提交。

（六）用于评价方法重现性的试验样品再分析

在方法验证中使用校正标样和质控样品可能无法模拟实际试验样品。例如，蛋白结合、已知和未知代谢物的回复转化、样品均一性或同服药物引起的差异，可能影响这些样品在处理和储存过程中分析物的准确度和精密度。因此，推荐通过在不同天后，在另外一个分析批中重新分析试验样品，来评价实际样品测定的准确度。检验的范围由分析物和试验样品决定，并应该基于对分析方法和分析物的深人理解。建议获得cmax附近和消除相样品的结果，一般应该重新分析10%样品，如果样品总数超过1000，则超出部分重新分析5%样品。 对于至少67%的重复测试，原始分析测得的浓度和重新分析测得的浓度之间的差异应在两者均值的±20%范围内。

试验样品再分析显示偏差结果的情况下，应该进行考察，采取足够的步骤优化分析方法。 至少在下列情形下，应该进行试验样品的再分析： ·毒动学试验，每个物种一次 ·所有关键性的生物等效性试验 ·首次用于人体的药物试验 ·首次用于患者的药物试验 ·首次用于肝或肾功能不全患者的药物试验

对于动物试验，可能仅需要在早期关键性试验中进行实际样品的再分析，例如涉及给药剂量和测得浓度关系的试验。 四、配体结合分析

配体结合分析主要用于大分子药物。前述的验证原则以及对试验样品分析的考虑一般也适用。但是由于大分子固有的特点和结构复杂性，使其难以被提取，所以常常在无预先分离的情况下测定分析物。此外，方法的检测终点并不直接来自分析物的响应，而来自与其他结合试剂产生的间接信号。配体结合分析中，每个校正标样、质控样品以及待测样品一般都采用复孔分析。如无特殊说明，本节以双孔分析为原则。 （―）方法验证前的考量 1. 标准品选择

生物大分子具有不均一性，其中成分的效价与免疫反应可能存在差异。因此应对标准品进行充分表征。应尽量使用纯度最高的标准品。用于配制校正标样和质控样品的标准品应尽量与临床和非临床试验使用的受试品批号相同。标准品批号变更时，应尽量对其进行表征和生物分析评价，以确保方法性能不变。 2. 基质选择

一般不推荐使用经碳吸附、免疫吸附等方法提取过的基质，或透析血清、蛋白缓冲液等替代实际样品基质建立分析方法。但在某些情况下，复杂生物基质中可能存在高浓度与分析物结构相关的内源性物质，其高度干扰导致根本无法测定分析物。在无其他可选定量策略的前提下，可允许使用替代基质建立分析方法。但应对使用替代基质建立方法的必要性加以证明。 可采用替代基质建立标准曲线，但质控样品必须用实际样品基质配制，应通过计算准确度来证明基质效应的消除。 3. 最低需求稀释度的确定 分析方法建立与验证过程中，可能需要对基质进行必要的稀释，以降低其产生的高背景信号。在此情况下，应考察最低需求稀释度。它是指分析方法中为提高信噪比、减少基质干扰、优化准确度与精密度而必须使用缓冲液对生物样品 进行稀释的最小倍数。应使用与试验样品相同的基质来配制加药样品来确定最低需求稀释度。 4. 试剂

方法的关键试剂，如结合蛋白、适配子、抗体或偶联抗体、酶等，对分析结果会产生直接影响，因此须确保质量。如果在方法验证或样品分析过程中，关键试剂批次发生改变，须确认方法性能不因此改变，从而确保不同批次结果的一致性。

无论是关键试剂，还是缓冲液、稀释液、酸化剂等非关键试剂，都应对维持其稳定性的保障条件进行记录，以确保方法性能长期不变。 （二）方法验证 1. 完整验证

（1）标准曲线与定量范围

标准曲线反映了分析物浓度与仪器响应值之间的关系。在配体结合分析方法中，标准曲线的响应函数是间接测得的，一般呈非线性，常为S型曲线。

应使用至少6个有效校正标样浓度建立标准曲线。校正标样应在预期定量范围对数坐标上近似等距离分布。除校正标样外，可使用锚定点辅助曲线拟合。

验证过程中，须至少对6个独立的分析批进行测定，结果以列表形式报告，以确定标准曲线回归模型整体的稳健性。拟合时，一条标曲允许排除由于明确或不明原因产生失误的浓度点。排除后应至少有75%的校正标样回算浓度在标示值的±20%（定量下限与定量上限在±25%）范围内。定量下限与定量上限之间的浓度范围为标准曲线的定量范围。锚定点校正样品是处于定量范围之外的标样点，用于辅助拟合配体结合分析的非线性回归标准曲线，

因其在定量范围之外，可不遵循上述接受标准。 （2）特异性

特异性是指在样品中存在相关干扰物质的情况下，分析方法能够准确、专一地测定分析物的能力。结构相关物质或预期合用药物应不影响方法对分析物的测定。如在方法建立与验证阶段无法获取结构相关物质，特异性评价可在最初方法验证完成后补充进行。应采用未曾暴露于分析物的基质配制高浓度与低浓度质控样品，加入递增浓度的相关干扰物质或预期合用药物进行特异性考察。未加入分析物的基质也应同时被测量。要求至少80%以上的质控样品准确度在±20% 范围内（如果在定量下限水平，则在±25%范围内），且未加入分析物的基质的测量值应低于定量下限。 （3）选择性

方法的选择性是指基质中存在非相关物质的情况下，准确测定分析物的能力。由于生物大分子样品一般不经提取，基质中存在的非相关物质可能会干扰分析物的测定。应通过向至少10个不同来源的基质加入定量下限和定量上限水平的分析物来考察选择性，也应同时测量未加入分析物的基质。选择性考察要求至少80%以上的样品准确度在±20%范 围内（如果在定量下限水平，则在±25%范围内），且未加入分析物的基质的测量值应低于定量下限。如果干扰具有浓度依赖性，则须测定发生干扰的最低浓度。在此情况下，可能需要在方法验证之前调整定量下限。根据项目需要，可能需要针对病人群体基质或特殊基质（如溶血基质或高血脂基质）考察选择性。 （4）精密度与准确度

应选择至少5个浓度的质控样品进行准确度、精密度以及方法总误差考察。包括定量下限浓度、低浓度质控（定量下限浓度的3倍以内）、中浓度质控（标准曲线中段）、高浓 度质控（定量上限浓度75%以上）以及定量上限浓度质控。低、中、高浓度质控标示值不得与校正标样浓度标示值相同，质控样品应经过冷冻，并与试验样品采用相同的方法进行处理。不建议采用新鲜配制的质控样品进行精密度与准确度考察。批间考察应在数日内进行至少6个独立的分析批测定。每批内应包含至少3套质控样品（每套含至少5个浓度的质控样品）。对于批内和批间准确度，各浓度质控样品的平均浓度应在标示值的±20%（定量下限和定量上限为±25%）范围内。批内和批间精密度均不应超过20%(定量下限和定量上限为25%）。此外，方法总误差（即％相对偏差 绝对值与％变异系数之和）不应超过30%（定量下限和定量上限为40%）。 （5）稀释线性

在标准曲线定量范围不能覆盖预期样品浓度的情况下，应使用质控样品进行方法的稀释线性考察，即评价样品浓度超过分析方法的定量上限时，用空白基质将样品浓度稀释至定量范围内后，方法能否准确测定。进行稀释实验的另一目的是考察方法是否存在“前带”或“钩状”效应，即高浓度分析物引起的信号抑制。 稀释线性考察中，稀释至定量范围内的每个QC样品经稀释度校正后的回算浓度应在标示值的±20%范围内，且所有QC样品回算终浓度的精密度不超过20%。 （6）平行性

为发现可能存在的基质效应，或代谢物的亲和性差异，在可获得真实试验样品的情况下，应考虑对标准曲线和系列稀释的试验样品之间进行平行性考察。应选取高浓度试验样品（最好采用超出定量上限的样品），用空白基质将其稀释到至少3个不同浓度后进行测定，系列稀释样品间的精密度不应超过30%。如果存在样品稀释非线性的情况（即非平行性），则应按事先的规定予以报告。如果在方法验证期间无法获取真实试验样品，则应在获得真实试验样品后尽快进行平行性考察。 （7）样品稳定性

应使用低、高浓度质控样品考察分析物的稳定性。稳定性考察应包括室温或样品处理温度下的短期稳定性，以及冻—融稳定性。此外，如果试验样品需要长期冻存，则应在可能冻存样品的每个温度下进行长期稳定性考察。每一浓度质控样品应有67%以上的样品浓度在标示值的±20%范围内。 （8）商品化试剂盒

商品化试剂盒可以用来进行试验样品分析，但使用前必须按本指导原则的要求对其进行验证。

2. 部分验证和交叉验证

在二、（二）和二、（三）中叙述的关于验证的各项内容都适用于配体结合分析。 （三）试验样品分析 1. 分析批

配体结合分析中最常使用微孔板，一个微孔板通常为一个分析批。每个微孔板应包含一套独立的标准曲线和质控样品，以校准板间差异。在使用某些平台时，单个样品载体的通量可能有限，此时允许一个分析批包含多个载体。可在该分析批的首个与末个载体各设置一套标准曲线，同时在每一载体上设置质控样品。所有样品均应复孔测定。 2. 试验样品分析的接受标准

对于每个分析批，除锚定点外，标准曲线须有75%以上的校正标样（至少6个）回算浓度在标示值的±20%（定量下限和定量上限为±25%)范围内。

每块板应含有至少2套3水平（低、中、高浓度）的复设质控样品。在试验样品测试过程的验证中，质控样品的复设数量应与试验样品分析一致。每块板至少67%的质控样品应符合准确度在±20%范围以内，精密度不超过20%的标准，且每一浓度水平的质控样品中至少50%符合上述标准。 3. 实际样品再分析

在3. 6节中关于实际样品再分析的所有论述均适用于配 体结合分析。再分析样品的接受标准为初测浓度与复测浓度 都在二者均值的±30%范围内，再分析样品中至少67%以上 应符合该接受标准。 五、试验报告

（一）方法验证报告

如果方法验证报告提供了足够详细的信息，则可以引用主要分析步骤的标准操作规程标题，否则应该在报告后面附上这些标准操作规程的内容。 全部源数据应该以其原始格式保存，并根据要求提供。 应该记录任何对验证计划的偏离。 方法验证报告应该包括至少下列信息： ·验证结果概要； ·所用分析方法的细节，如果参考了已有方法，给出分析方法的来源； ·摘要叙述分析步骤（分析物，内标，样品预处理、提取和分析）； ·对照标准品（来源，批号，分析证书，稳定性和储存条件）； ·校正标样和质控样品（基质，抗凝剂，预处理，制备日期和储存条件） ·分析批的接受标准； ·分析批：所有分析批列表，包括校正范围、响应函数、回算浓度、准确度；所有接受分析批的质控样品结果列表；储备液、工作溶液、质控在所用储存条件下的稳定性数据；选择性、定量下限、残留、基质效应和稀释考察数据； ·方法验证中得到的意外结果，充分说明采取措施的理由； ·对方法或对标准操作规程的偏离。

所有测定及每个计算浓度都必须出现在验证报告中。 （二）样品分析报告

样品分析报告应该引用该试验样品分析的方法验证报告，还应包括对试验样品的详细描述。 全部源数据应该以其原始格式保存，并根据要求提供。

应该在分析报告中讨论任何对试验计划、分析步骤或标准操作规程的偏离。 分析报告应至少包括下列信息： ·对照标准品； ·校正标样和质控样品的储存条件； ·简要叙述分析批的接受标准，引用特定的试验计划或标准操作规程； ·样品踪迹（接收日期和内容，接收时样品状态，储存地点和条件）； ·试验样品分析：所有分析批和试验样品列表，包括分析日期和结果；所有接受的分析批的标准曲线结果列表；所有分析批的质控结果列表，落在接受标准之外的数值应该清楚标出； ·失败的分析批数目和日期； ·对方法或标准操作规程的偏离； ·重新分析结果。

试验样品再分析的结果可以在方法验证报告、样品分析报告或者在单独的报告中提供。 对于生物等效性试验等，应在样品分析报告之后按规定附上受试者分析批的全部色谱图，包括相应的质控样品和校正标样的色谱图。