马振斌论文 - 图文

Caspase家族由14个成员组成，根据发现顺序被依次命名为Capase-1--Caspase-14。它们不仅在氨基酸序列有同源性、还在空间结构及底物特异性上具有相似性[24]。尤其是Caspase-3，它是Caspases家族中关键的凋亡执行者之一，在凋亡执行阶段，负责对全部或部分蛋白关键酶的剪切。Caspase-3广泛从在于各种细胞中，其前体相对分子质量为32000，活性形式的相对分子质量为17000[25]。Caspase-3能被多种因素活化，如可被Fas/Fasl途径活化，也可被颗粒酶B活化。在细胞凋亡启动时，Caspase-3将多聚聚合酶PARP（poly ADP-ribose polymerase）剪切成31 kD和85 kD两个片段，从而将PARP中与DNA结合的两个锌指结构与羧基端催化区域分离，使其丧失DNA修复和完整性监护的功能。 结果使受PARP负调控影响的Ca2+/Mg2+依赖性核酸内切酶活性增高，加速核小体之间DNA的裂解，引起细胞凋亡。 1.3.3 DNA损伤与细胞凋亡

DNA损伤是诱发细胞凋亡的一个诱因，其主要信号通路具有p53依赖性。具体来说，DNA损伤通过ATM蛋白和DNA依存性激酶（DNA-PK）的介导促进p53的表达；p53继而通过转录激活作用诱导p21waf表达，导致细胞凋亡[26]。细胞凋亡的一个显著特点是细胞DNA的降解。 细胞凋亡的这种DNA降解非常特异而且很有规律，所产生的不同长度的DNA片段约为180-200bp的整倍数，这正好是缠绕组蛋白寡聚体的长度，提示染色体DNA恰好是在核小体之间的连接部位被切断，产生不同长度的寡聚核小体片段。研究显示，这种DNA的有控降解是一种内源性核酸内切酶作用的结果，该酶在核小体连接部位切断染色体DNA，在琼脂糖凝胶电泳中就呈现特异的“梯状”条带，与坏死所呈现得弥漫连续图谱有明显区别[27]。

1.4 本研究的目的及意义

查阅国内外文献，对于柠檬酸的研究与讨论不再是局限于柠檬酸的生产及应用上，越来越多的专家和学者将精力放在了柠檬酸对机体影响的研究上。例如，国内研究方面，黄剑峰等做了柠檬酸对CHO细胞生长和代谢的影响的研究。国外研究方面，土耳其专家Aktac等人对单一毒性剂量的柠檬酸对小鼠的短期影响进行了研究。但纵观国内外报道，有关柠檬酸对肝细胞凋亡影响的研究还很少。故本研究通过对昆明小白鼠定期腹腔注射不同浓度的的柠檬酸，建立小鼠试验模型。最后采取小鼠肝脏组织，通过检测Caspase-3活性和观察DNA Ladder图谱，分析不同浓度柠檬酸对小鼠肝细胞凋亡的影响，为进一步研究柠檬酸对机体的毒副作用提供一定的理论依据。

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2 材料与方法

2.1 实验动物分组及处理

本实验用的昆明系小白鼠购于郑州大学动物医学院，共40只，随机分为4组：对照组，柠檬酸低、中、高剂量组，每组10只。待小鼠适应环境1周后，对各组小鼠进行如下处理：对照组，腹腔注射生理盐水；低剂量组，腹腔注射120 mg/kg·bw柠檬酸；中剂量组，腹腔注射240 mg/kg·bw柠檬酸；高剂量组，腹腔注射480 mg/kg·bw柠檬酸。每周注射一次，连续3周。

2.2 主要的仪器设备、试剂及其配制

2.2.1 主要仪器设备

SZ-93自动双重纯水蒸馏器，上海亚荣生化仪器厂； JH752紫外可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司； SIGMA1-15小型台式离心机，德国；

XW-80A 漩涡混合器，上海精科实业有限公司； DYY-11型电泳仪，北京六一仪器厂； DYCP-31C型电泳槽，北京六一仪器厂；

荧光/可见光凝胶成像分析系统（AlphaImager HP），美国； 光明电子万用炉，北京市永光明医疗仪器厂；

正华ZH-GL型离体组织灌流装置，淮北正华生物仪器设备有限公司；HH-6数显恒温水浴锅，金坛市晓阳电子仪器厂；

HHB11电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械一厂； JA2003电子天平，上海上平精密仪器有限公司； BLD-269/HL电冰箱，广东容声电器有限公司； BBD-386H冷柜，河南新飞电器有限公司；

DRAGONLAB微量移液器，Dragon Laboratory Instruments Limited；DR-200Be酶标分析仪，无锡华卫德朗仪器有限公司； SZ-93自动双重纯水蒸馏器，上海亚荣生化仪器厂； 2.2.2 主要试剂

柠檬酸(C6H8O7?H2O) 分析纯AR，成都市科龙化工试剂厂； Caspase -3活性检测试剂盒，碧云天生物技术研究所； 细胞凋亡-DNA Ladder抽提试剂盒，碧云天生物技术研究所； 考马斯亮兰蛋白测定试剂盒，南京建成生物工程有限公司 EB，碧云天生物技术研究所；

Tris平衡苯酚，北京索莱宝科技有限公司；

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氯仿，烟台市双双化工有限公司； 无水乙醇，烟台市双双化工有限公司； 5% 溴酚蓝，北京鼎国昌盛生物技术有限公司； 琼脂糖，北京鼎国昌盛生物技术有限公司；

Marker（NMW002），北京鼎国昌盛生物技术有限公司； EDTA，北京鼎国昌盛生物技术有限公司。 2.2.3 主要药品及试剂的配制

（1）0.9%生理盐水：NaCl 9 g，用少量的蒸馏水溶解，定容至1000 mL。 （2）柠檬酸注射液：用电子天平分别称取2.4 mg、1.2 mg、0.6 mg的柠檬酸，加入少量双蒸水溶解，然后定容至50 mL，最终浓度为：480 mg/L、240 mg/L、120 mg/L。

（3）5×TBE储存液：Tris 粉54 g，硼酸 27.5 g，0.5 mol/L EDTA（pH 7.9） 20 mL，加入蒸馏水定容至1000 mL。

（4）70%乙醇：70 mL无水乙醇，双蒸水定容至100 mL。

（5）1%琼脂糖凝胶：琼脂糖0.3 g，0.5×TBE 30 mL溶解并加热，煮沸后停止加热，加入EB 1 μL。

（6）10%电泳缓冲液：5×TBE储存液30 mL，蒸馏水定容至300 mL。 （7）磷酸盐缓冲液（PBS）：NaCl 9 g、NaH2PO4 0.4 g、Na2HPO4 6 g，加入800 mL双蒸水中溶匀，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1 L，保存于4℃冰箱中。

2.3 方法

2.3.1 小鼠肝脏组织采集及组织匀浆制备

第三次柠檬酸处理1周后，颈椎脱臼处死小鼠，剖开腹腔，取出肝脏，冰生理盐水漂洗，除去血液，滤纸拭干，称取肝脏组织，然后加入肝组织重量9倍的生理盐水，用玻璃匀浆器充分研磨小鼠肝脏组织并制成匀浆。将制备好的10% 组织匀浆，3000 r/min离心10~15 min，取匀浆上清液保存待用。 2.3.2 样品Caspase-3酶活性的测定

原理：Caspase-3可以催化底物Ac-DEVD-ρNA产生黄色的ρNA，在405 nm附近有强吸收，因此通过测定405 nm附近ρNA吸光度来检测Caspase-3的活性。Caspase-3酶活力单位定义：一个酶活力单位定义为当底物饱和时，在37℃可以剪切1 nmol Ac-DEVD-ρNA 产生1 nmol ρNA的Caspase-3 的酶量。

计算公式： OD值=ea

实际ρNA吸光度=A405标准品-A405标准品空白；

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Caspase-3催化产生的ρNA吸光度=A405样品-A405样品空白； ρNA浓度相当于A405的标准方程：A405=具体操作如下： （1）准备工作：

a. 裂解液溶解后混匀并置于冰浴上备用。 b. 检测缓冲液溶解后混匀并置于冰浴上备用。

a. 标准品稀释液的配制：按照每0.9 mL检测缓冲液加入0.1 mL裂解液的比例配制适量的标准品稀释液。

b. 将试剂盒提供的ρNA（10mM）用标准品稀释液稀释为0、10、20、50、100和200 uM，分别编号为A1、A2、A4、A5、A7、A8。

c. 每个浓度取适当量用容量不超过100 uL的比色杯进行检测，测定A405。 d. 每一个标准品的A405减去不含ρNA的空白对照得A405计算出实际的因ρNA而导致的吸光度，并制作出pNA浓度相当于A405的标准曲线。 （3）样品收集：

各实验组分别随机选取5个样品：

a. 肝脏组织匀浆：从-20 ℃冰箱中取出肝脏组织样品，根据取样量，每0.003——0.01g加入100 μL裂解液，在冰浴中用玻璃匀浆器匀浆。匀浆后将匀浆液转移到1.5 mL离心管中，继续冰浴裂解5 min。

b. 4 ℃ 下，16000-20000 r/min离心10-15 min。 c. 然后把上清液转移到冰浴预冷的离心管中。 d. 立即测定Caspase-3的酶活性或-20 ℃保存。 （4）Caspase-3酶活性的测定：

a. 取ρNA和适量的Ac-DEVD-ρNA（2 mM），置于冰浴上备用。 b. 如下设置反应体系：

试剂 检测缓冲液 待测样品 Ac-DEVD-ρNA (2mM)

总体积

在设置反应体系时先加检测缓冲液，再加待测样品，适当混匀，注意避免在混匀时产生气泡。然后再加入10 μL Ac-DEVD-ρNA（2 mM）。

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（2）测定pNA标准曲线：

空白对照 90 μL — 10 μL 100 μL 样品 80 μL 10 μL 10 μL 100 μL