生物制药技术试卷

②由于单个细胞难以存活，克隆化培养时需加入饲养细胞辅助其生长。 ③抗体的检测、鉴别。 （2）软琼脂法

是在培养液中加入0.5%左右的琼脂糖凝胶，将杂交瘤集落的单细胞悬浮液加入其中，细胞分裂后形成小球样团块。

由于培养基是半固体状态，可用毛细吸管将小球吸出，团块经打碎后再制成单细胞悬浮液，移入96孔板中继续培养和鉴定。

用这种方法可以吸出大量克隆细胞进行培养，因初代细胞很不易增殖，所以用软琼脂法进行克隆化容易成功。 7、简述动物细胞的培养特性。

答：动物细胞培养过程中具有以下特性： ①生长缓慢，易受杂菌污染，培养时需加抗生素。

②较微生物细胞大得多，无细胞壁，机械强度低，适应环境能力差； ③培养过程需氧量少，不耐受强力通风搅拌。

④在机体中，细胞相互粘连以集群形式存在，培养过程具有群体效应，锚地依赖性，接触抑制性及功能全能性。

⑤培养过程产生分泌于细胞内外，反应过程成本高，但产品价格昂贵。 ⑥大规模培养时，不可套用微生物反应的经验。 ⑦原代细胞和二倍体细胞系一般繁殖50代即退化死亡。 8、什么是二倍体细胞系？二倍体细胞系有哪些特点？

答：原代细胞经过传代、筛选、克隆，从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。 该细胞仍具备“正常”细胞的特点。

①、它的染色体组型仍然是2n的核型；

②、具有明显的贴壁依赖和接触抑制的特性。 ③、增殖能力有限，一般可连续传代50代。 ④、无致癌性。

9、说明噬菌体抗体库技术的基本方法？

答：①获得目的基因：提取B淋巴细胞mRNA，逆转录获得cDNA，PCR技术扩增全套V

5

②引入选择性标记基因。

③切除大部分多余序列段，以提高容纳外源DNA片段的能力。 ④引入由多种限制酶单一识别序列组成的多克隆位点。

⑤引入多种用途的辅助序列。 2、抗生素抗性基因失活法筛选含目的基因重组菌的原理和方法。 答：原理：

很多质粒载体都带有一个或多个抗生素抗性基因标记，在这些抗药性基因内有酶的

区编码基因。

②抗体库技术的载体：分别将VH和VL基因克隆入同一噬菌体（phagemid）载体，在噬菌体cp3基因与抗体V区编码基因间插入琥珀终止密码子。

③淘筛：抗原固定化后，对噬菌粒群的吸附、洗涤和洗脱后再感染扩增，与辅助噬菌体超感染获得大容量次级文库，再反复与抗原吸附，经几轮淘筛后，淘汰了非目的克隆，且使目的克隆大量扩增。

④表达与鉴定：目的克隆经过鉴定后，再导入感受态菌株，进行可溶性表达，其产物用western blot分析确定后，就完成了全过程。 五、问答

1、基因载体有哪些特性？如何将天然的原始载体改造成理想的基因载体？ 答：基因载体的特性：

①要有复制子功能，且复制起始区中没有限制酶的酶切位点。 ②要含有强启动子，要有能促进外源DNA高水平表达的调控区。

③要有多种限制酶的单一切点，以适用于多种限制酶产生的DNA片段的插入。

④具有两种以上易被检测的选择性遗传标记，作为对重组与非重组转化体的选择标记。 ⑤载体DNA的分子量要尽可能小，以利于容纳较长区段的外源DNA片段。 ⑥应属于松弛型复制，能在氯霉素存在下扩增其拷贝数。

⑦从安全防治考虑，载体应为非传递性，有较小的宿主范围，不为传递性载体所诱导。 将天然的原始载体改造成理想的基因载体： ①引入强启动子。

β-半乳糖苷酶。 识别位点，当用某种限制酶消化并在此位点插入外源目的DNA时，抗药性基因不再被表达。 因互补（称 α 互补） ，从而融为一体形成具有酶活力的

用于转化大肠杆菌的PBR322质粒是应用广泛的一种质粒载体，该质粒载体上带有

Ampr和Tetr的双抗药性标记。Ampr抗药性基因内有PstⅠ酶切位点，Tetr抗药性基因内有Bam HⅠ酶切位点。若用Bam HⅠ酶切割，且外源目的基因插入后，造成Tetr基因失活，转化后的重组细胞不能在含有Tet的培养基上生长，只能在含有Amp的培养基上生长，以此选择Ampr，Tets的重组细胞。反之，若在重组时用PstⅠ酶切割质粒PBR322，则目的基

由α互补而产生的Lac+细菌在有诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）和生色底

物5-溴-4-氯-3‵-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）的培养基上形成蓝色菌落。 当外源DNA片段插入到质粒载体的多克隆位点后，Lac Z‵片段失活，破坏了α互补作用。因此，带有外源目的DNA重组质粒的细菌将产生白色菌落，从而仅通过目测就可识别并筛选出带有重组质粒的转化子菌落。

5、目的基因DNA与载体DNA体外重组的定向克隆法和粘性末端连接 法各有何特点？如

因插入后，Ampr基因失活，转化后可选择Tetr、Amps。

何克服酶切后同一DNA片段自身环化？

方法（以外源基因插入Bam HⅠ位点为例）：

答：（1）定向克隆法：当用两种不同的限制酶（如用BamHⅠ和HindⅢ）消化同一DNA基因

r

由于外源基因插入，使Tet基因失活，变为对四环素敏感，但对氨苄青霉素的抗性没

组时，切下来的同一DNA片段带有非互补的突出末端，这样供体DNA片段只能以一个方向

有失活。先将转化后的细胞涂布在含有Amp的培养基上，淘汰大部分非转化子细胞，再将很容易地连接到同样用BamHⅠ和HindⅢ进行消化而产生相匹配粘性末端的载体DNA当中。 长出的菌落（一些含有重组质粒，另一些只含自身环化的质粒）用无菌环挑至含有Tet的培养基上，在此培养基上不能生长的菌落，即为外源基因插入质粒Tetr基因的Bam HⅠ位点的重组质粒。 3、杂交瘤细胞选择性培养的原理。

答：选择性培养基为HAT培养基，它是用次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶（T）配制的。其中氨基喋呤（A）能阻断DNA合成的主要途径。

骨髓瘤细胞因是HGPRT缺失型，无DNA合成的补偿途径，因此瘤细胞和瘤-瘤融合细胞因不能合成DNA而死亡。

而B细胞和B-B融合细胞在这样的离体培养条件下，无法生存几天内亦迅速死亡。骨髓瘤细胞是HGPRT（磷酸核糖转移酶）缺陷型，但B细胞中有这种酶，因此B-瘤融合的杂交瘤细胞含有HGPRT酶，可利用次黄嘌呤和胸腺嘧啶（T）来合成DNA，使杂交瘤细胞得以生长。

4、说明β-半乳糖苷酶插入失活法筛选含目的基因工程细胞株的原理和方法。

答：许多质粒载体（如PUC系列）都带有一个来自大肠杆菌的Lac操纵子的部分DNA区段（ Lac Z‵和调控序列Lac R），这一区段编码β-半乳糖苷酶N端的一个片段（但无酶活力）。宿主细胞可编码β-半乳糖苷酶C端的部分片段（也无酶活力），但两者之间可通过基

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特点：该法的优点是由于载体DNA片段两突出末端不互补，不能自身环化，但与目的基因DNA片段定向重组率却较高。

（2）粘性末端连接法：用一种限制酶酶切，会产生带有相同粘性末端的外源目的DNA片段，必须与用同一种限制酶消化而形成具有相同匹配末端的质粒载体相连接。

（3）用碱性磷酸酶去除载体DNA两端的5‵磷酸基团以尽量减少载体DNA的自身环化或连接。经去磷酸化的载体DNA仍然可有效地与具有5‵末端磷酸的外源DNA相连接。 6、什么是单克隆抗体？单克隆抗体有什么特点？请简述单克隆抗体制备的技术路线。 答：①由于一个B 细胞只会生产一种抗体。若能把 能产生某种所需要的抗体的B 细胞由脾脏中挑出來，单独培养成细胞株，则可得只会对一种抗原决定基 反应的专一性极高的单一种类的抗体，大量培养此细胞株，即可得品质一定、纯度均一的抗体，即为单克隆抗体（Monoclonal antibody，McAb）。 ②特点：

高度均一性： 纯度很高的均一性抗体

高度专一性：只对抗原分子上某一抗原决定簇起反应

大量产生及稳定性：杂交瘤细胞能在体内外无限繁殖传代，可工业化培养。 ③技术路线：

将淋巴细胞（B细胞）和骨髓瘤细胞经过PEG融合，得到融合细胞，然后通过HAT培养

特点：质粒载体DNA和外源DNA片段都可能发生自身环化，也有可能形成串联寡聚物。

基的筛选得杂交瘤细胞，再将杂交瘤细胞单克隆化得到不同的杂交瘤细胞克隆，再通过

①培养过程中细胞重量的增加主要取决于对数期，而次级代谢产生的累积则主要在稳定期

ELISA法筛选到能产生所需抗体的阳性克隆，最后工业化生产或免疫小鼠得到单克隆抗体。 完成。

②很少以单一细胞悬浮生长，而多以非均相集合体的细胞团形式存在。

7、如何用逆转录法获取含有目的基因的双链DNA？

细胞团的细胞数目通常在2~200之间，直径为2mm左右。

答：逆转录法获取含有目的基因的双链DNA：①从供体细胞中提取纯化总RNA。②从总

③随着培养时间的延长（对数生长后期）

，

RNA中分离获得mRNA。真核细胞中mRNA的3末端常含有一多聚腺嘌呤核苷酸组成的 细胞数量呈指数上升，开始分泌粘多糖和蛋白质，细胞密度高，培养基粘度大，易产生末端polyA，当总RNA的高盐缓冲溶液流经含有寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸-纤维素材料的层析柱时，根据碱基配对原则（A-T配对），mRNA被特异性地结合在柱上，用蒸馏水洗脱时，mRNA被洗脱下来。重复两次即可得到较高纯度的mRNA。 ③cDNA第一链的合成。 以mRNA为模板，寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸为引物，在逆转录酶作用下，以四种脱氧核苷三磷酸为材料，合成cDNA第一链。 ④ cDNA第二链的合成。用碱解或酶解的方法除去cDNA-mRNA杂交链中的mRNA链，然后以cDNA第一链为模板，在DNA聚合酶Ⅰ作用下合成第二链。用核酸酶Sl专一性地切除双链末端形成的发夹结构。

8、什么是基因插入失活？以转化大肠杆菌的PBR322质粒为载体，如 何用抗生素抗性基因插入失活法选择Ampr，Tets的重组细胞？

答：基因插入失活：很多质粒载体都带有一个或多个抗生素抗性基因标记，在这些抗药性基因内有酶的识别位点，当用某种限制酶消化并在此位点插入外源目的DNA时，抗药性基因不再被表达，称基因插入失活。

用于转化大肠杆菌的PBR322质粒是应用广泛的一种质粒载体，该质粒载体上带有Ampr和Tetr的双抗药性标记。Ampr抗药性基因内有PstⅠ酶切位点，Tetr抗药性基因内有Bam HⅠ酶切位点。若用Bam HⅠ酶切割，且外源目的基因插入后，造成Tetr基因失活，

混合和循环不良的问题。

④其纤维素的细胞壁使得其外骨架相当脆弱，抗张力强度大，抗剪切能力小，传统的搅拌或生物反应器容易损坏其细胞壁。

⑤所有植物细胞都是好氧的，需要连续供氧但不需要很高的气液传质速率，要控制供氧量，以保持较低的溶氧水平。

⑥植物细胞培养过程中有一少部分碳源是通过光合作用实现的，通气速率过高会驱除二氧化碳而抑制细胞生长，可在通气中加入一定二氧化碳来解决。

⑦植物细胞培养中泡沫问题不像微生物细胞培养那么严重。泡沫的性质也不一样且较大，细胞极易包埋在泡沫中而从循环培养液中带出，而造成非均相培养，通常要采用化学或机械方法加以控制。

10、什么是酶联免疫吸附试验？简述双抗体夹心ELISA的过程。

答：酶联免疫分析法是将酶作为标记物质，使之和抗原（或抗体）结合形成酶与抗原（或抗体）复合物，然后再根据待测抗体（或抗原）与复合物专一且定量的结合关系，通过测方法：①将抗体包被在固相载体上。

②样品中含有抗原，则结合为抗原抗体复合物。 ③加入酶标记抗体，则结合为抗体-抗原-酶标记抗体复合物。

定待测抗体（或抗原）结合的标记酶活力，从而计算出抗原或抗体的量的技术方法。

转化后的重组细胞不能在含有Tet的培养基上生长，只能在含有Amp的培养基上生长。 ④加底物并显色，比色法进行定性或定量分析。 先将转化后的细胞涂布在含有Amp的培养基上，淘汰大部分非转化子细胞，再将长出的菌落用无菌环挑至含有Tet的培养基上，在此培养基上不能生长的菌落，即为Ampr，Tets的重组细胞。

9、植物细胞培养的生理特点有哪些？ 答：植物细胞培养的生理特点：

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