基因工程（跨课程）综合性实验讲义 - 图文

基因工程（跨课程）综合性实验

4th 5. 表达影响因素试验（诱导时机）

3. 工程菌甘油种制备

每人1支，-20℃保存

5.2 表达诱导 转接3×LB+AP（20-50ml） 早、中、晚期诱导4hr 取GST菌株接2 mlLB+AP 诱导前后取样 测OD值 37℃培养过夜 5th 3×2菌体样 6. 表达进程分析 转接LB+AP摇瓶 5.2 表达因素实验 SDS-PAGE SDS-PAGE IPTG诱导5hr 脱色凝胶置于10%甘油保存 至第7天扫描 不同时间点取样 6th 诱导0、1、2、3、4、5hr菌体样 6.2 表达进程分析 SDS-PAGE SDS-PAGE 脱色凝胶置于10%甘油保存 至第7天扫描 7th SDS-PAGE 凝胶扫描分析 7．发酵工艺（观摩）

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基因工程（跨课程）综合性实验

8th 8、表达产物分离纯化

工程菌破菌、包涵体纯化、变性、复性、纯化（示教）

重组蛋白药物模块试验结果分析与讨论

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基因工程（跨课程）综合性实验

实验一 工程菌构建

（工程菌构建回顾）

1. pBV220-hIL-18表达载体和工程菌构建

在本综合性实验中目的基因的表达载体为pBV220，该载体的物理图谱见图2。该载体有一个氨苄青霉素抗性基因，在多克隆位点的上游为λ噬菌体的PL 和PR启动子，PL 和PR启动子受λ噬菌体CI基因的负调控。CI阻遏蛋白是温度敏感蛋白，在28-37℃培养时，CI产生抑制作用，在温度升至42℃时，CI被破坏，这样就解除了对启动子的封闭，使PL 和PR启动子开始下游基因转录。

目的基因为hIL-18的编码序列（cDNA），采用RT-PCR技术从外周血细胞中获得。首先据Genebank报道序列设计引物，并在引物的5’端引入EcoR I位点和启始密码子ATG，在3’端引入Hind Ⅲ位点。IL-18基因的RT-PCR扩增产物经EcoR I和Hind Ⅲ双酶切插入表达载体pBV220的相同位点即得hIL-18的表达载体pBV220-hIL-18。

构建的表达载体pBV220-hIL-18按常规方法转化大肠杆菌DH5α株后即得“重组hIL-18”的工程菌。

图3 pBV220的物理图谱

19 基因工程（跨课程）综合性实验

2. pGEX-GST表达载体和工程菌构建

pGEX-GST为商品化融合表达载体，主要用于外源基因的可溶性融合表达。GST（谷胱甘肽转移酶）为大肠杆菌宿主细胞的天然高效、可溶性表达的蛋白。以其作为融合表达“标签”有二点优势：a) GST可以促进二硫键的形成，使目的基因融合表达产物能正确折叠，因而常以可溶的表达产物存在；b)GST属于大肠杆菌高效表达的天然产物，其mRNA的5‘端具有最适的结构，有利于融合基因mRNA的翻译，因此可大大提高融合基因表达水平。

在pGEX-GST中，GST处于复合启动子Tac的控制之下，因此可采用IPTG诱导。其载体如图4所示，图中所示载体中还有一个特殊设计，即GST与目的蛋白的融合位点位PreScission蛋白酶识别位点，融合蛋白可在4℃下进行酶切反应，可避免其它蛋白酶类37℃那样的高温条件对目的产物的破坏。本综合实验中采取的是无外源基因的载体，即只表达GST，主要用于给同学们展示与pVB220-hIL-18不同的另一种启动子和表达诱导方式（PL/PR vs Tac；温控vs IPTG诱导），并便于“表达进程分析”。

图4 pGEX-GST的物理图谱

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