质粒DNA的提取酶切及其琼脂糖凝胶电泳实验报告

质粒DNA的提取酶切及其琼脂糖凝胶电泳实验报告

实验序号 实验名称 质粒DNA的提取、酶切及其琼脂糖凝胶电泳 实验时间 是否小组合作 是(?) 否( ) 一(实验预习

1(实验目的:

(1)通过本次实验学习和掌握碱裂解法提取质粒;

(2)通过本次实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术; 2(实验原理: 1)质粒DNA的提取: (1)关于质粒:

质粒是一类存在于几乎所有细菌中染色体之外(细胞质中)呈游离状态的双链、闭环的DNA分子。质粒通常携带有染色体上所不存在的能够表达产生抗生素、耐受重金属等重要性状的基因。细菌质粒的大小范围从1kb至200kb以上不等，且拥有自己的复制起始位点，可不依赖于染色体而进行独立自主复制。一些小的质粒利用宿主细胞的酶进行复制，而较大的质粒则自身携有复制与编码的有关酶。 (2)一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤:

?培养细菌，使质粒DNA大量扩增; ?收集和裂解细菌; ?分离和纯化质粒DNA。

分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。

(3)碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理:

碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。

在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确;而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，因复性较缓慢且不准确而相互缠绕形成不溶性网状结构。而复性的质粒DNA恢复原来构型，保持可溶性状态。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，最后用酚氯仿可以抽提纯化上清液中的质粒DNA。

2)质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳: (1)关于电泳技术:

电泳常用于分离和纯化那些分子大小、电荷性状或分个构象有所不同的生物大分子——尤其是蛋白质和核酸。正因为如此，电泳已成为生物化学和分子生物学中应用最为广泛的技术之一，其中在分子生物学实验中最为常用的是琼脂糖凝胶电泳。

琼脂糖是一种海藻多糖，琼脂糖胶分离范围很大，但其分辨率却相对较低。通过改变琼脂糖凝胶的浓度，应用标准的电泳技术可以分离200到50,000 bp 大小的 DNA 片断。一般琼脂糖胶浓度在0.5,到4,之间，且琼脂糖凝胶浓度越大，凝胶就越硬。较高浓度的琼脂糖胶有利于较小的DNA片断分离，而较低浓度的琼

脂糖胶则可以分离较大的DNA片断。 (2)琼脂糖凝胶电泳条带的观察:

通过观察示踪染料的迁移距离可以判断DNA的迁移距离。溴酚蓝染料在琼脂糖凝胶的迁移速率大小与300和4000bp大小的双链DNA片断相同。当迁移足够距离

后，就可以通过Gelview染色来观察DNA片断。Gelview是一种荧光染料。它可以在做胶时混入其中在电泳时进行染色，也可以待电泳完成后将凝胶浸泡在稀释的Gelview 溶液中进行染色 。但必须将凝胶置于紫外透射仪中才可以对凝胶中的DNA或RNA进行观察。

(3)质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分离:

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液环境中带负电荷，在电场中向正极移动，由于磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以相同的速度向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的构型和大小。具有不同分子质量或者不同构型的DNA分子泳动速率不一样，可以进行分离。

未切割的质粒DNA在其泳道上也许会出现几个条带，之所以这样是由于质粒DNA在琼脂糖凝胶中的迁移距离是由其分子构象及其碱基对大小所决定的。质粒DNA以下列三种主要构象中的任何一种形式存在:

? 超螺旋DNA:

尽管质粒通常以开环的形式进行描述，然而在细菌细胞内DNA链即是盘绕在组蛋白周围形成一种致密的结构。这就是所谓超螺旋结构，由于其结构致密，它在凝胶中的泳动速度最快。

? 线性DNA:

当DNA损伤在DNA双链相对应的两条链上同时产生切口时，就会出现线性质粒DNA，这种DNA的泳动速率介于超螺旋与切口质粒DNA之间。 ?开环DNA:

在质粒DNA复制过程中，拓扑异构酶I会在DNA双螺旋中的一条链中引入一个切口，解开质粒的超螺旋。在质粒分离过程中由于物理剪切和酶的切割作用同样也

会在超螺旋质粒中引入切口从而产生松散的开环结构。这种形式的质粒迁移速率最慢，其“松散”的分子形式阻碍了它在琼脂糖凝胶中的运动。

3( 实验器材:

(1)实验仪器(apparatus):

恒温培养箱(Constant temperature incubator)、恒温摇床(Constant temperature shaking table)、高速离心机(High speed centrifuge)、漩涡振荡器(Vortex mixer)、超净工作台(Bechtop)、高压灭菌锅(Autoclave)、微量加样器(Pipettes)、烧杯( beaker)、量筒 (graduated cylinder)、 玻璃棒(stir bar)、 微波炉(microwave)、 天平(Pan balance)、电泳梳子( comb)、电泳槽 (electrophoresis tank)、 电泳器 (Electro-phoresis System)、 紫外灯(Ultraviolet transilluminator )

3)、材料与试剂(Reagents): ?溶液I(Solution ?):

50mmol/L 葡萄糖;25mmol/L 三羟基甲基氨基甲烷(Tris)Tris-HCl(pH8.0);10mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA) pH8.0

溶液I可成批配制，每瓶约100ml，10磅高压蒸气灭菌15分钟，贮存于4?。 ?溶液?(Solution ?):新鲜配制，等体积混合

0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释);1% SDS (可用10,贮存液稀释配制)注意:SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。

?溶液III (Solution ?，100mL):加上后混匀会形成絮状沉淀 60mL 5mol/L KAc，

11.5mL 冰醋酸，

28.5mL HO (该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L) 2 ?TE液缓冲液:10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0);1 mmol/L EDTA(pH8.0) ?70% 乙醇;