生物工程生物技术专业英语翻译（六）

6.6.2 色谱方法

色谱方法用于低分子量的化合物（ 如同源抗生素），需要重溶混合物resolution，及巨大分子尤其是酶，产物有着及其相似的性质。必要的设备是柱子，填充有载体材料，通常是粒子， 储备和泵系统for洗脱液，有选择的收集洗脱组分。

根据具体的分离问题，柱子的比例可以变动，从相对高的窄的柱子到短的宽的柱子；一个例子是pharmacia segment column，这个柱子是由不锈钢构建的。为了获得最大处理量，采用大小均匀的微粒；柱的填充常常受到在分离的罐中混合吸附剂与溶剂系统的影响，如果需要在减少的压力下除气，然后以稠的糊状物传递到柱子中。某些物质尤其是在分子筛层析中使用的那些物质，当用缓冲液与有机溶剂平衡或者用不同离子强度的缓冲液平衡（ 盐梯度洗脱）的时候，体积发生变化，然后必须固定到柱子中采用可调节的end-plate。柱子可以进行向上和向下流动操作，通常安装有泵输入的液体的流动计和一个输入压力控制装置。在柱子的两端安装无菌滤纸是所需要的，以消除细菌的污染和可能的产物破坏。

通常情况下需要控制每一阶段从柱子上被洗脱下来的组分，如遵照洗脱液在254nm和280nm处的紫外吸收分别是核酸和蛋白质；缓冲液梯度通过衡量电导性来控制，或者

在极端情况下，安装自动分析仪旁路途径来控制。为了分开已分离的产物需要某些形式的部分收集器，而且对于使用有机溶剂的大规模分离过程，this must be a flame-proof installation in an explosion-proof room.

不同的层析过程可以按下列区分为： ? 吸附 ? 离子交换 ? 凝胶过滤 ? 疏水 ? 亲和 ? 共价 ? 分配

这些层析的特性描述如下。

吸附层析 分离产物依据的是它们对固体介质表面不同的吸

附性，可以是无机载体如硅胶、氧化铝或者羟基磷灰石，也可以是有机多聚物。

离子交换层析 使用的这类树脂已经讲述过了，或者使用不可溶或交联的多糖（纤维素，琼脂糖），离子功能基团吸附到上面。它对巨型分子的分解高；图6.9给出了分解复杂的蛋白质混合物的例子。这个所示的是生产规模的人血浆蛋白的分离，通过联合离子交换层析第4，6步与凝胶过滤第2，9步。

凝胶过滤 利用 “分子筛”效应的，即一种中性的交联载体其

有确定的孔大小以进行分子的分离。大于最大孔的分子不能进入到介质内部而直接通过柱子；小一些的分子进入载体内部并被保留；这样分散到孔中是由于孔大小的作用，所以保留的分子就可以按照分子大小减小的顺序洗脱下来。

与分子量范围从几百到百万或者更大相对应，就需要大范围的可控孔大小的载体；它们通常由线性多聚物产生（葡聚糖、琼脂糖），受交联度的控制。这些一般在溶液系统中使用，凝胶过滤液可以用于多肽或者蛋白质溶液的除盐。引入相对疏水基团的分子筛可以在有机溶剂中使用，以相同的方式分离亲脂性物质。

疏水载体 具有不同疏水性的分子可以在含有疏水基团的

载体上得到分离。因此，许多酶和其他蛋白质具有疏水区域，该区域积累中性氨基酸（如缬氨酸、苯丙氨酸），将与连接有不同长度酰基的载体发生不同程度的相互作用。

亲和层析 利用更专一的相互作用进行分离；在固体支持物

载体上连接上一种特定的结构，并且与欲分离的化合物发生特异的相互作用。分离原理如图6.10所示。特异性效应物如酶的抑制剂（I）固定在不溶于水的载体上（C），载体被填充到一个柱子中。引入含有不同酶（E1、E2、E3、E4….）的复杂混合物的中性缓冲液，当E1被抑制剂I复杂化，所有剩下的酶通过柱子。采用不同pH的缓冲液，现在，酶E1就可

以选择性的从柱子上洗脱下来。可以分离的典型的特异性效应物与互补分子包括：

酶/酶的抑制剂（或反之亦然） 抗体/抗原或者半抗原（or vice versa） 外源凝集素/糖蛋白或多糖 核酸/互补碱基序列 激素/受体 维生素/载体蛋白 等等

这种类型的分离依赖于相同的高特异性相互作用，这种作用调控着生物过程。例如，脱氢酶根据它们与辅酶的特异性作用采用带有键合的NAD+的琼脂糖载体可以进行分离。可以利用抗原/抗体反应：例如经过带有固定的单克隆抗体的琼脂糖层析，人白细胞介素以高产量且高纯度形式得到回收。显而易见，这种固定的特异性效应物的成本是非常高的，应该多次循环使用。

为了制备特异性固定物，载体如琼脂糖凝胶in head form要被活化，例如通过与溴化氢反应，然后当连接的是小分子的时候如辅酶，就可以直接进行连接，或者当要连接的是较大的效应物分子的时候通过“手臂”分子进行连接。

基团－特异性亲和层析 以相似的方式采用低特异性的“化

学”相互作用；例如，带有二羟硼基的多聚物可以分离糖蛋白