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第三篇 发酵工程产物的提取
第十一章 发酵工程下游技术发展及发酵液的预处理 第一节：发酵工程下游技术发展
一、下游技术领域及发酵产物分类(5-8min) 1.引入概念
在前11周，我们学习了菌种选育、种子培养、发酵过程控制等内容，以上为发酵的上游部分，区分上游和下游的关键是判断“发酵结束”，标准为产品质量和经济效益。
2.定义：下游技术（工程）（downstream processing）：对于由生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应等各种生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术。（重点）
3.从工业发酵范畴来看，从发酵液中获得的发酵产物大致可分为三类 ：菌体、酶、代谢产物 。发酵液中的杂质：菌体、蛋白、有机酸
4.举例：酶的分离纯化；葡萄酒的纯化
二、下游加工过程在生物技术中的地位（3min）
1.组成：下游加工过程是生物技术的重要组成部分，发酵液或反应液需要经过下游加工过程才能成为成品；
2.费用：传统发酵工业中下游部分的费用占整个工厂投资费用的６０％，而对重组ＤＮＡ生产蛋白质等基因工程产品，下游加工的费用可占整个生产费用的８０％－９０％；
3.关注程度：英国政府工业部于１９８３年发起生物分离计划（ＢＩＯＳＥＰ），专门研究下游加工过程；１９８７年英国化学工业会召开了专门讨论下游加工过程的国际会议；我国也于１９８９年在济南召开了一次专门会议；近十年来国内外有关生物分离或蛋白质纯化的专著陆续出版。
三、下游加工技术的特点（3min） 1.目的产物在初始原料中的含量较低;
2.含目的产物的初始物料组成复杂,除了目的产物外，还有大量的细胞、代谢、残留培养基、无机等，特别是产物类似物对目的产物的分离纯化影响很大；
3.目的产物的稳定性差，具有生物活性的物质对 pH、温度、金属离子、 有机溶剂、剪切力、表面张力等十分敏感，容易是其失活、变性；
4.种类繁多，包括大、中、小分子、结构简单或复杂的有机化合物，以及结构复杂又性质各异的生物活性物质；
5.应用面广，对其质量、纯度要求高，甚至要求无菌、无热源。 四、生物工业下游技术的发展历程（3min） 1.古代酿造业
古代酿造业包括酿酒、制酱（油）、醋、酸奶和干酪等。技术原始、家庭式作坊、产物基本不经过后处理而直接使用，无下游技术。
2. 第一代生物技术
主要指19世纪60年代---20世纪40年代青霉素等抗生素出现之前的生物技术产业。发现了发酵的本质是微生物的作用，掌握了纯种培养技术，生物技术进入近代酿造产业的发展阶段。到20世纪上半叶，逐渐开发形成了发酵法生产酒精、丙酮、丁醇等微生物发酵工业（厌氧发酵），其产品相对简单，基本上是无活性的小分子。此时开始引入过滤、蒸馏、精馏等近代分离技术。
3. 第二代生物技术
以20世纪40年代出现的青霉素产品为代表。
无菌空气制备技术、大型好氧发酵装置开发，一大批通风发酵技术产品相继投入了工业生产，如抗生素（链霉素）、氨基酸（谷氨酸）、有机酸（核酸、柠檬酸）、酶制剂（淀粉酶）、微生物多糖和单细胞蛋白等。产品多样性决定了分离方法的多样性。借鉴和引进吸收了大量的近代化学工业的分离技术，如沉淀、离子交换、萃取、结晶等。
4.近期的生物技术
20世纪80年代以来，生物工业下游技术进步很快，出现了很多新概念、新技术、新产品和新装备。大致可分为以下几大类
（1）固液分离技术
近20年来，将在污水处理、化学工程和选矿工程上广泛使用的絮凝技术引入到发酵液的预处理上，研究开发了菌体及悬浮物絮凝技术，改善了发酵液的分离性能，加之纤维素助滤剂的开发，大大提高了发酵液的固液分离效率。在固液分离机械方面，也出现了一些性能优良的新型机械，如带式过滤机、连续半连续板框过滤机、螺旋沉降式离心机等。微滤膜可高效分离细微的悬浮粒子。
（2） 细胞破碎技术
已开发出珠磨破碎、压力释放破碎、冷冻加压释放破碎和化学破碎等技术。该技术的成熟使得胞内生物物质的大规模工业化生产成为可能。
（3）初步分离纯化技术主要开发了沉淀、离子交换、萃取、超滤等技术。较早出现的是酶及蛋白质的盐析法；有机溶剂沉淀法；双水相萃取技术比较适合于胞内活性物质和细胞碎片的分离，为进一步纯化精制创造了前提；超滤技术解决了生物大分子对pH、热、有机溶剂、金属离子敏感等难题，在生物大分子的分级、浓缩、脱盐等操作中得到了广泛的使用。
（4）高度分离纯化技术
小分子物质一般可通过离子交换、脱色和结晶、重结晶等方法获得纯度很高的产品。生物大分子的纯化一直是个难题。20世纪70年代以来，逐渐开发出各种色谱（层析）技术，如亲和色谱、疏水色谱、聚焦色谱、离子交换色谱和凝胶色谱等，后两种技术已开始用于批量生产。
（5）其他新型分离技术
超临界CO2萃取技术在获得天然生物物质方面有着独特的优势。20世纪80年代以来，已经在许多领域中迅速实现了工业化。如啤酒花中有效成分和咖啡豆中咖啡因的萃取分离。介于反渗透和超滤之间的纳米滤技术，由于其能使水和大部分无机盐通过而截留分子量300-1000的小分子有机物，且操作压力低，在生物工业和水处理中具有广阔的应用前景。渗透蒸发技术、液膜技术及反胶团技术的研究和应用开发等也相继取得了很大的进展。
第二节 发酵工业下游技术的一般工艺过程（5min）
成熟的化工单元：蒸馏、萃取、结晶、吸附、蒸发和干燥等属传统的单元操作； 新近发展起来的单元操作：如细胞破碎、膜过程和色谱分离等，缺乏完整的理论；
介于两者之间的有离子交换过程等。 1、 一般工艺过程
一般说来，下游加工过程可分为4个阶段：培养液(发酵液)的预处理和固液分离；初步纯化(提取)；高度纯化(精制)；产品的最后加工。
预处理和固液分离：目的是除去发酵液中的菌体细胞和不溶性固体杂质（离心和过滤）。 初步分离：目的是除去与产物性质差异较大的杂质，为后道精制工序创造有利条件 （萃取、吸附、沉淀、蒸发）
高度纯化：去除与产物的物理化学性质比较接近的杂质（层析、膜分离、离子交换、沉淀、电泳）。
产品的最后加工：成品形式由产品的最终用途决定（结晶、干燥、蒸馏）。
2.如何着手对一种未知的发酵产品进行提取
（1）分离过程的控制参数
（2）设计中应考虑下列问题
What is the value of the product? （产品价值） What is an acceptable product quality? (产品质量） Where is the product in each process stream? （产物在生产过程中出现的位置）
Where are the impurities in each process stream?（杂质在生产过程中出现的位置） What are the unusual physicochemical properties of the product and the principal impurities?
（主要杂质独特的物化性质是什么？）
What are the economics of various alternative separations? （不同分离方法的技术经济比较）
第三节 发酵液预处理
引言：
从微生物发酵液或细胞培养液中提取生化物质的第一个重要步骤，就是预处理和固液分离。其目的不仅在于分离细胞、菌体和其他悬浮颗粒，还希望除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，以利于后续的各步操作。 一、发酵液预处理工艺
各种发酵产品，由于菌种不同和发酵液特性不同，其预处理方法的选择也有所不同。大多数发酵产物存在于发酵液中，但也有少数产物存在于菌体中，或发酵液和菌体中都含有，但无论产物是在胞内，还是在胞外或者是菌体本身，首先都要对发酵液进行过滤和预处理，将固、液分开，然后才能从澄清的滤液中采用物理、化学的方法提取代谢产物，或从细胞出发进行细胞破碎、碎片的分离和提取胞内产物。
预处理的方法完全取决于可分离物质的性质，如对PH和热的稳定性、是蛋白质还是非蛋白质、分子的质量和大小等等。具体方法主要有以下几种：
1、加热法
加热法是最简单和价廉的预处理方法，即把悬浮液加热到所需温度并保温适当时间。加热可降低液体的黏度，根据流体力学的原理，滤液通过滤饼的速率与液体的黏度成反比，可见降低液体黏度可有效提高过滤速率；同时，在适当温度和受热时间下可使蛋白质凝聚，形成较大颗粒的凝聚物，进一步改善了发酵液的过滤特性。例如，链霉素发酵液，调酸至PH3.0后，加热至70℃，维持半小时，其黏度下降至原来的1/6，过滤速率可增大10～100倍。
使用加热法时必须严格控制加热温度和时间。首先，加热的温度必须控制在不影响目的产物活性的范围内；其次，温度过高或时间过长，会使细胞溶解，胞内物质外溢，增加发酵液的复杂性，影响产物后续的分离与纯化。因此，加热法的关键取决于产品的热稳定性。
2、调节悬浮液的PH值
PH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，因此适当调节发酵液的PH值可改善其过滤特性。此法是发酵工业中发酵液预处理较常用的方法之一。对于Aa、Pro等两性物质，在等电点时，其溶解度最小，这就是等电沉淀法。例如，在味精生产中，利用等电点（PH3.22）沉淀法提取谷氨酸；在膜过滤中，发酵液中的大分子物质容易与膜发生吸附，通过调整PH值改变易吸附分子的电荷性质，即可减少堵塞和污染。
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