黑木耳菌丝液体发酵培养产黑色素培养条件优化

预实验：黑木耳液体发酵培养黑色素培养基优化

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种：黑木耳 1.1.2 主要试剂

土豆 KH2PO4 MgSO4 葡萄糖 蔗糖 麦芽糖 可溶性淀粉 蛋白胨 酵母膏 硫酸铵 尿素 盐酸

1.1.3 主要仪器

摇瓶培养箱 分析天平 150r/min 摇床 分光光度计 离心机 水浴锅 真空冷冻机

1.2 培养基的制备

1.2.1 PDA培养基

土豆汁20%+葡萄糖2%+琼脂2%，pH值自然。 1.2.2 发酵液液体种子培养基 PDB

土豆汁20%+葡萄糖2%，pH值自然。 1.2.3 摇瓶发酵实验培养基

1） 碳源筛选试验培养基：土豆汁20%+KH2PO4 0.3%+MgSO4 0.15%+蛋白胨0.15%+碳源2%

2） 氮源筛选试验培养基：土豆汁20%+KH2PO4 0.3%+MgSO4 0.15%+葡萄糖2%+氮源2% 3） 无机盐试验培养基：土豆汁20%+葡萄糖2%+蛋白胨0.15%+不同配比的微量元素 4） pH试验培养基：

土豆汁20%+KH2PO4 0.3%+MgSO4 0.15%+蛋白胨0.15%+葡萄糖2%+不同pH条件 5） 转速：

土豆汁20%+KH2PO4 0.3%+MgSO4 0.15%+蛋白胨0.15%+葡萄糖2%+不同转速 6） 正交试验培养基：设计采用四因素三水平正交表

1.3 实验方法

1.3.1 黑木耳菌丝发酵培养

1) 菌种培养（活化菌种）:从母种试管中取菌丝块接种于PDA平板中，于25℃培养7d 2) 液体种子培养（扩大并制备液体菌种）:将活化的菌种切割成黄豆大小的菌丝块，接种入装有100mL液体培养的250mL三角瓶中， 30℃，150r/min培养7d，备用。 3) 发酵培养（单因素实验）:摇瓶中装入不同的摇瓶发酵实验培养基100mL，接种量为10%，于30℃,150r/min培养4d。 1.3.2 黑色素的分离与提纯

① 将培养一段时间的发酵液取出，过滤除菌体；

② 用1moL/L的HCl调节滤液的pH为2,10000r/min离心15min；

③ 去上清，取沉淀，在沉淀物中加蒸馏水震荡混匀，用1mol/L的HCl调节pH为2， 10000r/min离心10min；

④ 反复三次后，去上清，沉淀用蒸馏水洗离心3次； ⑤ 取沉淀冷冻干燥，即为黑色素纯品。 1.3.3 黑色素含量标准曲线的制作

① 取进过分离提纯的黑色素干燥至恒重，取1.00mg溶于25mL蒸馏水中，制成原液。 ② 将原液进行两倍稀释，制成不同浓度梯度

③ 将原液与浓度梯度稀释液在OD400条件下测量其OD值，根据结果绘制黑色素含量标准

曲线，求出k值。

1.3.4 摇瓶发酵培养实验中发酵液黑色素含量的测定

① 根据标准曲线的k值及测定时发酵液稀释的倍数N，可测出黑色素含量。 黑色素含量= OD400 × k × 稀释的倍数N （mg/L）

② 通过黑色素含量的对比可得出发酵黑色素的优良培养基组成。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 碳源筛选试验

表1 碳源筛选试验

碳源 OD400

黑色素含量（mg/L）

2.1.2 氮源筛选试验

表2 氮源筛选试验

氮源 OD400

黑色素含量（mg/L） 2.1.3 无机盐筛选试验

表3 无机盐筛选试验 KH2PO4（g/100ml）

0.1 0.2 0.3 0.4

2.1.4 pH筛选试验

表4 pH筛选试验

pH

OD400

黑色素含量（mg/L）

2.1.5 转速筛选试验

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

MgSO4（g/100ml）

0.05 0.10 0.15 0.20

OD400

黑色素含量（mg/L）

蛋白胨

酵母膏

硫酸铵

尿素

葡萄糖

蔗糖

麦芽糖

可溶性淀粉

表5 转速筛选试验

转速（r/min） OD400

黑色素含量（mg/L）

120

130

140

150

160

2.2 培养基正交优化实验

根据单因素实验确定黑木耳菌液体发酵培养的最适碳源为葡萄糖（G），最适氮源为蛋白胨，最适无机盐含量为KH2PO4 0.3%,MgSO4 1.5%,最适pH为5.5 条件下采用L9（34）表进行实验，发酵条件为30℃，摇床转速为150r/min ，发酵培养7d。

表5 实验因子

水平因子

1 2 3

A(G) 1% 2% 3%

B(蛋白胨) 0.1% 0.15% 0.2%

C（K KH2PO4）

0.1% 0.2% 0.3%

D（MgSO4）

0.05% 0.1% 0.15%

表6 各组分L9（34）正交实验结果 水平因子

1 2 3 4 5 6 7 8 9

A(G) 1 1 1 2 2 2 3 3 3

B(蛋白胨)

1 2 3 1 2 3 1 2 3

C（KH2PO4） D（MgSO4） OD400

1

2 3 2 3 1 3 1 2

1 2 3 3 1 2 2 3 1

黑色素含量（mg/L）

3 结论

参考文献

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