植物根际促生细菌(PGPR)研究进展及其应用

输到植物茎内；然而，却不能进入大多数豆科植物的茎内，因为在植物根内就被内酯酶有效降解。某些植物产生和分泌AHL类似物，干扰根际细菌的AHLs信号，因为许多病原细菌也是利用自诱导剂或群体感应信号化合物对植物进行攻击。最近发现，革兰氏阴性细菌中含有经过修饰的AHL信号物质，其酰基侧链被源自植物的香豆酸所取代。发现放射根瘤菌（Rhizobium radiobacter）产生coumaroyl-AHLs, 与植物促生真菌Piriformo- spora indica.密切相关。目前为止，尚不清楚根际细菌是否普遍产生coumaroyl-AHLs、以及能诱导伴生根瘤菌和植物产生哪种应答（Schuhegger, et al., 2006）。

2.1.2 焦磷酸测序技术（Pyrosequencing）在细菌群落结构分析中的应用

焦磷酸测序技术能够从分离自土壤的DNA产生数以千计的短DNA序列，这些序列提供了细菌群落结构的分类学信息。Yin等利用该方法研究了耕作制度和轮作对土壤细菌群落结构的影响，设计2×2因子试验，包括2个轮作处理（小麦-小麦和小麦-大豆）、2个耕作处理（常规和免耕），每个处理4个重复。分别采集土壤样品，提取土壤DNA，扩增16s rDNA。通过焦磷酸测序，获得了20,180 个 16S rDNA序列，在97%相似性水平上，产生了2337 个运筹分类单位 (OTUs) 。其中最丰富的分类群（Acidobacteria）是酸杆菌门；丰富的分类群还包括芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、放线菌目（Actinomycetales）和α-变形细菌（Alphaproteobacteria）。绝大多数酸杆菌存在于所有处理土壤中；不同处理土壤中还有其差异性类群，例如，群1 主要出现在小麦连作土壤，而群4 主要出现在小麦-大豆轮作土壤。 这些结果通过群特异性引物进行的实时PCR得到验证。这种高通量的测序方法提供了全部细菌群落分类学信息，能够检测栽培措施等人为因素引起的细菌群落结构变化（Yin, et al., 2010）。

2.1.3 蛋白质组学方法在PGPR-根际相互作用研究中的应用

蛋白质组学是生物学研究中快速发展的领域之一，可用于研究植物根际各种环境因素，如根分泌物中的植物信号、盐等，对PGPR蛋白质组表达的影响。采用双向凝胶电泳技术检测了植物根际信号分子、镍和盐对PGPR菌株P. putida UW4及其突变株UW4/AcdS （ACC 脱氨酶基因缺失）蛋白质组的影响，结果表明，植物根分泌物信号分子、镍和盐等因子引起蛋白质组表达发生很大变化。采用质谱技术对差显蛋白进行鉴定发现，这些差显蛋白中许多蛋白与养分运输和利用、细胞荚膜合成、环境胁迫适应、抗氧化过程、重金属外排和转录或翻译调控有关；在PGPR-根际相互作用中可能具有重要重用。从P. putida UW4中克隆几个表达水平发生极大变化的差显蛋白基因，构建差显蛋白基因超表达或完全缺失突变株。对这些突变株进行的功能研究发现，与野生型菌株相比，其植物促生能力发生了很大变化。上述结果证实，这些差显蛋白与PGPR-根际相互作用有关（Cheng, et al., 2009a, 2009b, 2009c, 2010）。

2.2 PGPR功能基因组学

2.2.1 荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）Pf-5抗真菌代谢物合成的基因组学分析

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目前已经完成了几个PGPR假单胞菌（Pseudomonas spp.）测序工作，为通过基因组学方

法揭示PGPR作用机制提供了新的机会。荧光假单胞菌(P. fluorescens) Pf-5是一株具有良好生防功能的PGPR，2005年完成测序工作，其基因组大小为7.07 Mb（Paulsen, et al., 2005）。 荧光假单胞菌(P. fluorescens) Pf-5的环状基因组图谱见图1。该菌株基因组中，约6%的基因与次级代谢物合成有关，包括抑制土传病原真菌和卵菌（Oomycetes）的抗生素和与铁离子吸收有关的2种铁载体；还鉴定出3个功能未知的孤儿基因簇（Loper& Gross, 2007）。荧光假单胞菌(P. fluorescens )Pf-5基因组含有的抗生素合成基因簇见图2。

图1 Pseudomonas fluorescens Pf-5 的环状基因组

图2 P. fluorescens Pf-5基因组中抗生素合成基因簇

采用一种新的“基因组-同位素组合方法”（genomisotopic approach），即基因组分析和同位素引导的分级分离相结合，发现了其中1个孤儿基因簇的产物为orfamide A ，可能与植

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物病害控制有关的一类新的环脂肽。利用RT-PCR检测技术，优化有利于Pf-5 菌株ofaA、ofaB和ofaC 基因表达的培养条件。对预测的orfamide A中的1个亮氨酸进行同位素标记，然后添加到培养基中，采用NMR技术对培养液中的多肽进行分级分离，获得了orfamide A的结构（图3）。

图3 “基因组-同位素组合方法”从Pf-5培养物中分离Orfamide A的原理图

(a) orfamide A 生物合成基因：ofaA、ofaB和ofaC，编码非核糖体肽合成酶(NRPS)；

(b) 在OfaA、OfaB和OfaC中有10个模块 (M1–M10) ，每个模块包含1个缩合结构域 (C)、腺苷酰化结构域 (A)和硫醇化结构域 (T) 。OfaC 的3’末端含有2个硫酯酶结构域(TE) 。

2.2. 2 解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens ）FZB42基因组比较分析

解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）FZB42是一株革兰氏阳性的植物根际促生细菌，促进植物生长，产生次级代谢产物、抑制植物土传病害。其基因组大小为3,918kb，含有3,693 个蛋白编码基因。缺乏噬菌体插入序列，而这在枯草芽孢杆菌168菌株基因组中存在较多。FZB42 基因组分析表明，该菌株具有产生多种次级代谢产物的潜力，包括聚酮化合物bacillaene和difficidin。8.5% 以上的基因与抗生素和铁载体的非核糖体肽合成有关。除含有5个在枯草芽孢杆菌（B. subtilis）168菌株中已知的非核糖体肽合成基因簇外，还含有4个168菌株所缺乏的4个大基因簇。pks2 基因簇编码合成macrolactin 核心骨架的组件。

与细菌-植物相互作用有关的基因：FZB42 有效定植于植物根际是其促进植物生长的先

决条件。细菌根际竞争与其形成生物膜的能力有关。FZB42基因组含有丰富的生物膜形成相关基因。包括胞外多糖合成操纵子epsA-O。RBAM00750, RBAM00751和 RBAM00754基因编码具有胶原蛋白GXT结构基序的蛋白质，可能与表面附着和生物膜形成有关。swrA编码的蛋白质和surfactin是FZB42群体移动所必需的，也与其在根面定植和营养捕获有关。FZB42基因组含有262个可能具有分泌信号功能的蛋白质，被信号肽酶I型(150个基因产物)、II型(98个基因产物)和Tat系统(14个基因产物)所识别。FZB42碱性丝氨酸蛋白酶AprE与角质降解胞外蛋白酶具有很高的同源性（98%），可以杀死植物病原线虫。FZB42基因组含有大量的胞

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外大分子水解酶基因，使其在植物表面生长。FZB42还产生植酸酶，在植物根分泌物存在时，其合成高水平提高；磷饥饿诱导PhoP/R双组分系统的合成，进而调节植酸酶的合成。根分泌物还刺激与氧化胁迫应答相关酶合成上调；植物根际氧化胁迫是由硫醇过氧化物酶或分解植物根分泌物的酶 (如bacillopeptidase F、g-谷酰基转肽酶、磷酸转乙酰酶)催化反应过程中产生的。蛋白质组学分析表明，鞭毛钩相关蛋白HAP1、HAP2和鞭毛蛋白HAG合成受植物根分泌物的影响。尽管在根分泌物存在时，flgK基因产物HAP1水平降低，fliD表达水平和hag基因产物 (HAP2、HAG) 水平上调。鞭毛蛋白诱导植物对病原菌的防卫反应；在FZB42在植物根表面定植过程中，鞭毛蛋白及其他表面蛋白合成水平的变化可能提高了FZB42对不利的植物应答的耐受性，进而提高了其根际竞争能力。研究表明，枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌产生的挥发性化合物3-羟基-2-丁酮（乙偶姻）和2,3-丁二醇等促进植物的生长；这些挥发性化合物也与引发植物系统诱导抗性有关。乙酰乳酸合成酶催化两分子丙酮酸缩合形成乙酰乳酸，AlsD催化乙酰乳酸脱羧基产生3-羟基-2-丁酮。FZB42 也含有催化2,3-丁二醇合成途径的基因。芽孢杆菌（Bacillus spp. ）通过产生吲哚乙酸（IAA）、赤霉酸等植物激素促进植物生长。在喂养色氨酸情况下，FZB42能够合成IAA。FZB42基因组中含有3个与IAA代谢相关基因具有明显同源性的候选基因：ysnE (编码蛋白与巴西固氮螺菌的IAA乙酰转移酶相似)、dhaS (与Ustilago maydalis的吲哚-3-乙醛 乙醛脱氢酶相似)和yhcX（可能的睛水解酶，与拟南芥的睛水解酶相似）。YsnE和YhcX 参与 IAA 生物合成。

与生防有关的基因簇：解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）FZB42基因组中，含有9个生物活性肽和聚酮化合物合成基因簇；编码具有模块化组织的非核糖体肽合成酶（NRPSs）和聚酮合成酶(PKS)，指导多肽和聚酮化合物的生物合成。在枯草芽孢杆菌（B. subtilis）168基因组未发现bmy、mln、dfn和 nrs基因簇。除溶杆菌素（bacilysin）生物合成基因簇外，其他基因簇的活性均依赖于Sfp, 将4’-磷酸泛酰巯基乙胺从辅酶A转移到初生肽或聚酮链的载体蛋白上。表1概括了FZB42基因组所含的各种非核糖体肽和聚酮合成基因簇（Chen, et al., 2007，2009）。

表1. B. amyloliquefaciens FZB42 和 B. subtilis 168基因组中NRPS和 PKS基因簇

Compound Surfactin BacillomycinD Fengycin Putative peptide Bacillibactin Bacilysin/ anticapsin Macrolactin Bacillaene Difficidin Enzyme NRPS NRPS/ PKS NRPS NRPS NRPS NRPS PKS PKS/ NRPS PKS FZB42 srfABCD、aat、ycxC、ycxD、sfp、yczE bmyCBAD fenABCDE nrsABCDEF dhbABCDEF bacABCDE、ywfG mlnABCDEFGHI baeBCDE、acpK、 baeGHIJLMNRS dfnAYXBCDEFGHIJKLM B. subtilis 168 srfAA、AB、AC、AD、 ycxA、ycxB、ycxC、ycxD Not present ppsABCDE Not present dhbABCDEF ywfBCDEFG Not present pksBCDE、acpK、 pksGHIJLMNRS Not present Identity% 73–83 0 60–65 0 60–80 84–93 0 52–83 0 16