生物医用高分子材料在人造红血球的应用研究与进展

Thematic Forum(Medical Polymer Materials)专题(医用高分子) 技术生物医用高分子材料在人造红血球的应用研究与进展黄宇彬 景遐斌 石全 孙静 陈学思 中国科学院长春应用化学研究所，高分子物理与化学国家重点实验室 (长春 130022)内容提要： 输血作为一种生命救治和人体机能维持的重要手段，已经广泛应用于临床实践当中。人造红血球的研究是解决目前临床使用上存在的诸多弊端（血型、病毒感染、保质期短等），并可以安全高效的应用于紧急突发事件中的一个重要手段。本文从人体红血球的构造和基本功能出发，详细介绍并评价了人造红血球研究的发展过程和最新进展，归纳了新型人造红血球材料的设计要求，论述了医用高分子材料在人造红血球领域的应用优势，提出了生物可降解高分子与血红蛋白分子结合开发新型人造红血球的设计思路并开展了初步的科研工作。关 键 词： 人造红血球 血红蛋白 可降解材料Research and Progress on the Application of Artificial Red Blood Cells Using Biomedical Polymer MaterialsHUANG Yu-bin JING Xia-bin SHI Quan SUN Jing CHEN Xue-si State Key Laboratory of Polymer Physics and Chemistry, Changchun Institute of Applied Chemistry, Chinese Academy of Sciences (Changchun 130022)Abstract: Blood transfusion is commonly used in the clinical trails for saving lives and keeping normal function of the human organs. However, there are many shortcomings in the donated blood, for example, the blood type matching, the limited preservation time, the shortage of the blood bank, and the virus contamination (like HIV or Hepatitis) of the blood product. Therefore, an artificial blood substitute with high safety, high efficacy and large-sacle produced is needed. In this article, the authors made a brief introduction and the evaluation on the history and progress of the research on synthesis of artificial red blood cells. The designation demand for the synthesis of new type of artificial red blood cells was summed up, and the core consideration to combine hemoglobin with biodegradable biomedical polymer materials was presented.Key words: Artificial Red Blood Cell, Hemoglobin, Bio-degradable Polymer文章编号：1006-6586(2009)05-0005-06 中图分类号：R318.08 文献标识码：A

前言

命的延误；更为严重的是，通过输血和其他血液制品在大多数情况下，外伤造成的大量失血继而引发造成的病毒传染，如艾滋病毒，肝炎病毒等，已经对主要脏器的衰竭是威胁患者生命的主要因素。因此，血液工业的信赖度形成了严重的冲击。因此，制造一及时有效的输血操作是进行生命救治，并维护人体机种安全，高效，并且能被迅速应用于紧急突发事件的能正常运转的重要手段，已经广泛应用于临床手术、人工血液，已经成为一个紧迫的任务。

抗灾和战场救护当中。然而传统的输血措施无论在战近几十年来人血液代用品一直是国际科学界和企场急救、还是在重大灾害时都存在着较大弊端。首先业界关注的研究开发热点[1-6]，研发种类繁多，从人造是血型问题，血型的测试昂贵耗时，寻找相同血型的红血球、人造血小板、人造血浆到人造免疫体系，涵盖献血者有时很困难；其次，医院库存的新鲜血液通常

了人体血液的主要功能性组分。其中，人造红血球的研

只能在4?C下保存3个星期，过期不能再使用；第三，究是人血液代用品研究的重要组成部分，一方面是由于近年来献血者日趋减少，血库存血严重短缺，在处理红血球是人血液中最主要的成分，承担着氧气传输维持紧急大出血的患者时或发生重大事故时，往往造成致

生命系统的重要功能；另一方面，由于人血成分与功能

收稿日期：2009-04-29

作者简介：黄宇彬，博士，研究员，博士生导师

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的多样性和复杂性，试图开发一种囊括血液所有功能的是因为(1)失去红细胞内2，3–DPG调节，血氧解离万能血液代用品是不现实的，也是没有必要的。

曲线左移，使血红蛋白氧亲和力升高，影响氧的释放，人造红血球，也称人红细胞代用品(human red cell 不能向组织有效供氧；(2)血红蛋白在血浆中胶体渗透substitutes)，是具有氧传递功能、维持血液渗透压和酸压高，四聚体在循环中的半寿期仅为2~4h，迅速分解碱平衡及扩充容量的人工制剂。理想的血液代用品要成二聚体和单体并从肾脏滤过，同时由于游离的血红求具有天然红细胞的传递氧功能、生物相容性、安全蛋白四聚体分子及其分解产物能渗透血管内皮进入器性和稳定性。即：(1)具有较高的携氧能力，氧分压在官及组织间质，引起严重的副作用。(3)引起动脉压、正常生理范围内，能有效向组织供氧；(2)与人血液所

肺动脉压及全身血管阻力的平均值升高。这种增高的

有组分具有良好的生物相容性；(3)能维持血液渗透压、效应可能和游离Hb分子与NO结合有关。NO是一种酸碱平衡、粘稠度和血容量；(4)无免疫原性(无致敏很强的血管舒张剂，血管内连续释放NO以维持全身原性)、无血液病原微生物污染、无热源；(5)体内循和肺动脉压血压正常。同时，血红蛋白分子本身也具环半寿期在24 h以上，在正常灌注条件下不产生肾毒有收缩血管特性。这种收缩血管效应可能影响肾脏血性等副作用；(6)在低温条件下，产品保质期大于6个月；液和全身血液的分配。(4)血红蛋白失去红细胞内还原(7)具有预期的可清除性。同时，作为一种产品，它的酶系统调节，易氧化成高铁血红蛋白，失去携氧能力市场生命力还取决于同现行输血用血液相比的更合适并产生自由基。所以降低血红蛋白氧亲和力、稳定血的价效比，安全度以及保质期。

红蛋白四聚体，避免其氧化是血红蛋白作为血液代用研究人血液代用品的关键是如何取代血液中红细品的必要条件。

胞的输送氧的功能。由于来源于红细胞本身的血红蛋白(Hb)具有高效的载氧能力和维持胶体渗透压的2 第一、二代人造红血球以及全合成型人造红血球

功能，当前各国都将研制以血红蛋白为基质的携氧剂红血球代替物的研究主要集中在美国、日本。到(hemoglobin based oxygen carriers, HBOC)作为血液代目前为止，人造红血球的研究大致分成2个领域：以用品研究开发的主攻方向，而大量的生物医用高分子血红蛋白为基础的氧气载体；全合成型氧气载体。血材料的结合应用已经成为未来高性能高效率高性价比红蛋白载体又分为非细胞型(或修饰型)血红蛋白和细的人造红血球产品研发的必不可少的条件。

胞型(或包接型)血红蛋白；全合成氧气载体又分为全氟化碳(per?uorocarbon)乳液和全合成血红素。

1 红血球与血红蛋白

而基于血红蛋白的人血液代用品的种类如图2所人体的红血球是一种直示，分为三代。第一代血液代用品为分子修饰血红蛋白，径大约8μm、中间凹陷的圆在国内外均得到了研究[7, 8]，如今国外已处于临床实验盘状粒子，在红血球细胞膜阶段；第二代血液代用品，即把血红蛋白分子与超氧内包含着浓度为35%的血红化物歧化酶(SOD)等红细胞内的酶交联形成的偶联物蛋白(Hemoglobin, Hb)，这也已得到研究[9]。这些非细胞型人造红血球在实际应用是氧气传输的核心物质，而

图1 血红蛋白的结构

中普遍出现的问题是，由于粒径较小， 血红蛋白分子经红血球细胞膜上的糖蛋白则是构成血型匹配的主要成由血管壁渗出，与血管内皮细胞的松弛因子NO相吸分。血红蛋白的结构如图1，四个亚基构成一个接近于附，引起血管收缩，造成血压增高，造成代谢异常以球体的分子，直径5.5 nm，分子量64,500 Da。通过血及轻度的神经性副作用。另外，输入体内会造成胶体红蛋白的精制和提纯，可以很好的实现不含血型、长渗透压升高和大量高铁血红蛋白的形成，同时，因为期保存、无菌无毒的效果。

血红蛋白直接暴露在外，导致其容易被氧化或者被免但未经修饰的血红蛋白不能作为血液代用品，这

疫系统攻击从而失效，在体内循环半衰期也较短(10~20

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专题(医用高分子) 技术h)。这些问题归根到底来源于与人体红血球较大的尺寸和构造差异。

越来越多的研究发现，只有采用同人体红血球相近的细胞形态来设计红血球替代物，才能更有效的发挥血红蛋白的氧气传输功能，并减小副作用。

图2 红细胞，血红蛋白和几种血液代用品的示意图

全合成型白蛋白-血红素载体rHSA-heme是用白蛋白分子承载人工合成型血红素，通过其自主的结合解离氧分子来实现氧气传输功能，目前处在动物实验阶段(日本早稻田大学)[10，11]。这一工作，通过人工合成血红素衍生物(Heme)为载氧基元，以基因重组白蛋白为水溶性载体，以聚氧乙烯(PEG)为免疫清除屏蔽物，第一次得到了一种完全合成型，在生理条件下(37oC, pH 7.4)可以同氧气分子发生可逆的结合解离作用，同血液一样暗红色的rHSA-heme人工氧气运载体。rHSA-heme最多可以结合8个血红素分子，并有平均6条分子量为2000或5000的PEG为外层屏蔽分子。调制好的rHSA-heme溶液，在室温下保存1年以上，其各项指标如密度、粘度、浊度、pH值、白蛋白浓度、heme浓度以及氧气亲和性等都没有明显变化，显示出良好的稳定性。同人体红血球一样，在氧气或者氩气的反复作用下，rHSA-heme同氧气发生可逆的结合解离现象，并表现出特征的紫外吸收光谱。在PEG的保护下，血红素的血液循环半衰期提高了30倍以上。在氧气亲和性方面，rHSA-heme同红血球大致相同，表现出不逊于红血球的氧气输送能力。相关的动物模型试验也表明，rHSA-heme具有较高的血液相容性，对极度缺血的大鼠模型具有很高的输入安全性和氧气传输有效性。目前存在的问题主要有2点，一个是rHSA-heme溶液的氧气传输基元含量偏少，浓度过低，实际应用效果有待进一步确证；同时，血红素衍生物的合成工作量巨大，价格昂贵，和现行的多种血液代用品相比不具有优势。

3 第三代人造红血球

从上世纪90年代初期到现在，研究者们致力于第三代红细胞代用品的开发，它们与第一代和第二代红细胞代用品明显的区别是在携氧单元外面用膜包覆，使之更加接近红细胞的实际结构，避免外来的携氧单元与免疫系统直接接触[12]，这种体系被称作HbV(Hemeglobin Vesicle),它主要利用已经超过保存期限的血液样品，通过精制手段获得纯化的血红蛋白，再利用磷脂双分子膜包裹高浓度的血红蛋白分子形成细胞状微粒。Suematsu

等[13, 14]对肝微循环的研究指出，血管壁具有100 nm左右的多孔结构，因此游离的血红蛋白(直径5 nm左右)会渗透出血管，并对肝细胞产生毒性，理想的HbV大小控制在200~400 nm为宜。通过造粒技术得到的HbV胶囊的粒径被控制在250nm左右，没有从血管壁缝隙中渗出的危险，同时又能够通过狭小的毛细血管以实现氧气传输过程。由于精制过程中去除了细胞膜，因此不再存在血型的问题。同时，通过对磷脂双分子膜进行高分子物质修饰，不但避免了小胞体之间凝集，也大大延长了其在血液中的循环半衰期。这种血红蛋白小胞体在

常温下可以保存2年以上不发生变化。1999年，Philips

等以聚乙二醇修饰的脂质体磷脂膜包裹血红蛋白，得到了在体内循环时间较长的红细胞代用品[15]。近年来，日本早稻田大学的Tsuchida教授课题组在HbV领域作

了许多令人瞩目的工作[16-18]。目前它的制造工艺已经初

步形成，正在利用风险公司的投资以实现大规模生产。从目前来看，价格上不具备优势，工艺也比较复杂。

国内早在上世纪70~80年代就已经开始了人造血的研究，主要以仿制为主，诸如全氟化碳乳液、HbV、血红蛋白修饰体等等，始终紧跟国际前沿，包括四川大学、医学科学院、协和医科大学、天津大学、中科院过程工程研究所等单位都做了卓有成效的工作。中

图3 血红蛋白胶囊HbV体系

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科院过程工程研究所还和企业联合，推出了白蛋白-血红蛋白聚合体这样的新型的红血球代替物。国内的研景遐斌等研究人员，进行了使用可降解纳米胶束(胶囊)显示出令人振奋的研究结果。作为HbV基体的工作[19-22]，

究大多数仍然停留在实验室阶段，只有极少数进入了他们首先合成了两亲性的PEG-MPC-PLA聚合物，动物和临床前实验，其研发进展处于保密状态。

然后在胶束的憎水核的表面利用click反应键合了血红蛋白，并对携氧能力进行了测试。作为两亲性的嵌段

4 人造红血球研究的最新进展

共聚物，PEG-MPC-PLA在水中可以形成如图4所示的双亲性的嵌段共聚物或接枝共聚物通过自组装可

胶束结构，水溶性的PEG链在水溶液中作为壳可以起

以形成纳米至微米尺度的胶束、胶囊(囊泡)以及形状、到稳定内核的作用，而MPC和PLA段作为憎水的核结构各异的其它聚集体。控制共聚物中亲水链段和疏

被包在内部，而且由于聚合物链段是由外而内的嵌段

水链段的结构和长度，可以获得很低的临界胶束浓度，结构，因此直接连接在PEG端的MPC段会聚集在核因而相对于小分子胶束或胶囊，如脂质体，这些高分的外层，PLA段在内层，形成一个双层的核。这样设子聚集体在人体条件下不需要特殊的稳定化措施就能计的目的首先是在胶束核的表面形成碳-碳叁键的环境，够稳定存在。纳米胶束或胶囊的形成主要决定于聚合以键合血红蛋白；其次，在溶液中，胶束表面的PEG物链段的溶解性，而不依赖于聚合物是否荷电，是否链段伸展开来，可以有效地保护血红蛋白免受氧化和存在电子受体/给体对等，因而具有较宽的材料选择范免疫系统的攻击。在这个结构中，最内层核的PLA提围。许多生物降解的高分子及其共聚物独有这种自组供了胶束的生物相容性，生物降解性和机械性能；外装功能，因而这些组装体在人体条件下可以完全生物

层核的MPC提供了血红蛋白的键合位点，同时也具有

降解，无毒性，无残留，也无免疫原性，适合在体内使用。良好的生物相容性和生物降解性；外层的PEG链段在因而它们可以用作生命活性物质的载体，用于生物医水溶液中是可以自由伸展的；键合在胶束核上的血红学领域，典型的应用有纳米胶束或纳米胶囊药物输送蛋白则起携氧的作用，构成了一个完整的基于血红蛋和控制释放体系，蛋白质和基因载体，胰岛胶囊等。

白的携氧单元。

纳米技术的发展为设计合成更适应人体需要的红键合血红蛋白的胶束的紫外光谱显示(图5)，其血球模拟物提供了有力的工具。目前，通过双亲性聚在419nm处具有血红蛋白分子独有的特征峰，表明了合物获得尺寸均一、形态完美的纳米胶束或胶囊已经血红蛋白在本身性质没有变化的情况下被成功地键合不十分困难。问题是如何将血红蛋白引入高分子纳米到了胶束上。而络合在血红蛋白卟啉环上的CO分子在胶束或胶囊，一个胶束或胶囊中包裹足够数量的血红光照的情况下可再次被氧气取代，并且这种变化是可蛋白，使胶束或胶囊接近红血球的大小，又具有与红逆，从而证明了键合血红蛋白的胶束具有优异的氧气血球相当的氧气传输功能，并且在长时间的血液循环结合和解离的功能。

过程中保持完整无损的胶束或胶囊状态和功能。

近年来，用生物降解聚合物如PEG-PLGA等作为HbV基体的研究受到了越来越多的重视，与其他方法相比，这种方法有着独特的优点，首先，聚合物具生物可降解性，在完成输氧任务后，可降解为对人体无害的乳酸、水和CO2排出体外；

其次，聚合物的结构容易控制，可以通过控制聚合物的结构来调控HbV的图4 血红蛋白与胶束键合过程的示意图

大小和聚集方式等；最后，聚合物在强度上也优于磷在他们的另一部分工作中，他们又采用了聚氨基脂膜等，所以相同条件下聚合物基材的用量要少于磷

酸材料作为血红蛋白的载体。这不仅是因为聚氨基酸

脂膜。最近，中国科学院长春应用化学研究所的黄宇彬、可以作为一种模型来研究自然界的蛋白质，而且是因

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