微生物学类实验指导书（下）

MgSO4·7H2O 1g，NaCl 0.5g ，琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH 7.0 。调好pH后，加入12ml 0.4g/L的溴甲酚紫作指示剂，121℃湿热灭菌20min。 4. 产酶微生物菌种的选育

生物的遗传信息的改变是通过基因突变、基因重组和基因转移来进行的。基因突变，又称点突变（point mutation），包括自发突变和诱发突变，前者是未经人为施加诱变剂处理而发生的突变，后者是经人为施加诱变剂处理而获得的突变。两种突变都是由于一个或几个碱基的增加、缺失或置换而引起的，因此本质相同，不同的只是诱发突变的频率比自发突变的频率要高得多。这一部分的实验是以紫外线和亚硝基胍为例介绍了物理因素和化学因素对微生物的诱变作用。本实验中，学生将筛选出的淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶的产生菌株作为出发菌株通过紫外线和亚硝基胍即物理因素和化学因素对微生物的诱变作用，对以上菌株进行选育工作。特以淀粉酶产生菌株作为出发菌株，经过紫外线和亚硝基胍的诱变作用，根据透明圈直径与菌落直径的比值，可初步确定淀粉酶的高产菌株为例来介绍本实验内容。 4.1 实验目的 通过实验观察紫外线和亚硝基胍等理化因素对微生物的诱变效应，并掌握基本方法。 4.2 实验原理

基因突变可分为自发突变和诱发突变。许多物理因素、化学因素和生物因素对微生物都有诱变作用，这些能使突变率提高到自发突变水平以上的因素称为诱变剂。

紫外线（UV）是一种最常用的物理诱变因素。它的主要作用是使DNA双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶间形成二聚体，阻碍双链的分开、复制和碱基的正常配对，从而引起突变。紫外线照射引起的DNA损伤，可由光复活酶的作用进行修复，使胸腺嘧啶二聚体解开恢复原状。因此，为了避免光复活，用紫外线照射处理以及处理后的操作应在红光下进行，并且照射处理后的微生物放在暗处培养。

亚硝基胍（NTG，N-甲基- N-硝基-亚硝基胍）是一种有效的诱变剂，在低致死率的情况下也有很强的诱变作用，故有超诱变剂之称。它的主要作用是引起DNA链中GC-AT的转换。亚硝基胍也是一种致癌因子，在操作中要特别小心，切勿与皮肤直接接触。凡有亚硝基胍的器皿，都要用1mol/LNaOH溶液浸泡，使残余的亚硝基胍分解破坏，然后清洗。

本实验分别以紫外线和亚硝基胍作为单因子诱变剂处理产生淀粉酶的菌株，根据试验菌诱变后在淀粉酶培养基上透明圈直径的大小来指示诱变效应。一般来说，透明圈越大，淀粉酶活性越强。 4.3 实验仪器与材料 筛选出的淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶的产生菌株、淀粉培养基、LB液体培养基、溶液和试剂、亚硝基胍、碘液、无菌生理盐水、无菌水试管等；1 mL无菌吸管、玻璃涂棒、血细胞计数板、显微镜、紫外线等（15W）、磁力搅拌器、台式离心机、震荡混合器等。 4.4 实验方法与步骤

4.4.1 紫外线对出发菌株的诱变效应

1）菌悬液的制备：① 取培养48小时生长旺盛的出发菌株斜面4-5支，用10 ml 无菌生理盐水将菌苔洗下，倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。② 将上述菌液离心（3000 r/min，离心15分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2-3次，最后制成菌悬液。③ 用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。

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2）平板制作：将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板27套，凝固后待用。

3）紫外线处理：① 将紫外线灯开关打开，预热约20分钟。② 取直径6cm无菌平皿2套，分别加入上述调整好细胞浓度的菌悬液3ml，并放入一根无菌搅拌棒于平皿中。③ 将上述2套平皿先后置于磁力搅拌器上，打开皿盖，在距离为30cm，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟和3分钟。盖上皿盖，关闭紫外灯。

4）稀释：在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。

5）涂平板：取10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0.1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。

6）培养：将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养48小时。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。

7）计数：将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。

8）观察诱变效应：将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5-6个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）。与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。此斜面可作复筛用。 4.4.2 亚硝基胍对试验菌的诱变效应

1）菌悬液的制备：① 将试验菌斜面菌种挑取一环接种到含5 ml淀粉培养液的试管中，置37℃震荡培养过夜。② 取0.25ml过夜培养液至另一支含5 ml淀粉培养液的试管中，置37℃震荡培养6-7h。 2）平板制作：将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板10套，凝固后待用。

3）涂平板：取0.2 ml上述菌液放到一套淀粉培养基平板上，用无菌玻璃涂棒将菌液均匀地涂满整个平板表面。

4）诱变：① 在上述平板稍靠边的一个位点上放少许亚硝基胍结晶，然后将平板倒置于37℃恒温箱中培养24h。② 在放亚硝基胍的位置周围将出现抑菌圈。

5）增殖培养：① 挑取紧靠抑菌圈外侧的少许菌苔到盛有20mlLB液体培养基的三角瓶中，摇匀，制成处理后菌悬液，同时挑取远离抑菌圈的少许菌苔到另一盛有20mlLB液体培养基的三角瓶中，摇匀，制成对照菌悬液。② 将上述2只三角烧瓶置于37℃震荡培养过夜。

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6）涂布平板：分别取上述两种培养过夜的菌悬液0.1ml涂布淀粉培养基平板。处理后菌悬液涂布6套平板，对照菌悬液涂布3套平板。涂布后的平板，置37℃恒温箱中培养48h。实际操作中可根据两种菌液的浓度适当地用无菌生理盐水稀释。注意每套平板背面作好标记，以区别经处理的和对照。

7）观察诱变效应：分别向菌落数在5-6个的处理后涂布的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）。与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。此斜面可作复筛用。 4.5实验结果

1）将紫外线诱变结果填入下表；

紫外线诱变结果 稀释倍数 平均菌落 处理时间 （数/皿） 诱变剂 （min） 0（对照） 1 3 10-4 10-5 10-6 存活率% 致死率% 紫外线 （UV） 2）观察诱变效应，并填入下表；

诱变效应记录表 透明圈和菌落直径大小（㎜）及其HC比值 1 透菌 HC明 比圈 落 值 2 透菌 HC明 比圈 落 值 3 透菌 HC明 比圈 落 值 4 透菌 HC明 比圈 落 值 5 透菌 HC明 比圈 落 值 6 透菌 HC明 比圈 落 值 结果 处理 UV处理 NTG 对照 4.6问题和讨论

1) 用于诱变的菌悬液（或孢子悬液）为什么要充分振荡？2) 经紫外线处理后的操作和培养为什么要在暗处或红光下进行？3) 分析你的实验结果：① 你是否获得了比对照株产淀粉酶更高的突变株？试分析其可能的原因。② 从你的实验结果中，说明致死率与诱变效应的相关性。

实验二 产酶微生物的发酵与保藏

1. 淀粉酶产生菌的发酵及酶活力测定 1.1 实验目的

目的：1）了解淀粉酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线。2）了解淀粉酶的性质及淀粉酶的

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测定原理。掌握淀粉酶的发酵及酶活力测定方法。

内容：1）绘制试验菌的生长曲线。2）淀粉酶的发酵。3）液化型淀粉酶活力的测定。4）糖化型淀粉酶活力的测定。 1.2 实验原理

淀粉是由葡萄糖通过α-1，4糖苷键构成的直链淀粉和α-1，6位有分支的支链淀粉组成的。按照水解淀粉方式的不同，主要的淀粉酶可分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和解枝酶（或异淀粉酶）4大类。产淀粉酶的微生物有细菌、霉菌和酵母菌等。

液化型淀粉酶又称α-淀粉酶，属单成分酶。除单纯的酶蛋白外，没有辅酶。α-淀粉酶能任意切开淀粉分子α-1，4-葡萄糖糖苷键，将长链淀粉降解为短链的糊精，使淀粉黏度迅速下降，失去对碘的呈色反应。水解终产物为麦芽糖和少量葡萄糖。它不能水解支链淀粉的分支点α-1，6-糖苷键，也不能切开靠近分支处的α-1，4-糖苷键，但可以越过α-1，6-糖苷键而切开内部α-1，4-糖苷键。支链淀粉的水解终产物除麦芽糖和少量葡萄糖外，还留下带有α-1，6-糖苷键的寡糖。由于生成的糖是α-型的，所以叫α-型淀粉酶。

液化型淀粉酶（即α-1，4-糊精酶，或称α-淀粉酶）能将淀粉分子键中的α-1，4-葡萄糖糖苷键任意切断，形成长短不一的短链糊精及麦芽糖和少量葡萄糖，使淀粉对碘呈蓝紫色特异反应逐渐消失，以该颜色消失的速度计算酶的活力。

葡萄糖淀粉酶系统名为淀粉-α-1，4-葡聚糖葡萄糖水解酶，俗称糖化酶，是国内酶制剂中产量最大的品种。糖化酶对淀粉分子的作用是从还原性末端切开α-1，4-糖苷键，也能切开α-1，3-糖苷键和α-1，6-糖苷键，生成葡萄糖。生产糖化酶常用的菌种是黑曲霉，其在查氏平板上生长菌落呈扩散形，菌丝白色，有时出现黄色区域，绒状，有明显的辐射波纹，无渗出液，边缘生长较薄，咖啡色，反面为淡黄色。

将活化好的菌种制成菌悬液，转接到三角瓶直接进行发酵，测定酶活力。 1.3 实验仪器与材料

1.3.1 菌种：产液化型淀粉酶芽孢杆菌或产糖化酶黑曲霉斜面菌种。 1.3.2 酶源：淀粉酶发酵液。

1.3.3 培养基及试剂：种子培养基，牛肉膏蛋白胨培养基；发酵培养基，葡萄糖2g/L，NaCl 2g/L，Na2HPO4 1.6 g/L，(NH4)2SO4 1.6g/L；调pH至7.2；液化型淀粉酶活力检测试剂、糖化型淀粉酶活力检测试剂。 1.3.4 仪器及用具：摇床、721型分光光度计、比色试管、25×250mm试管、25ml具磨口塞试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶等。 1.4 实验方法与步骤 1.4.1绘制试验菌的生长曲线

大多数细菌的繁殖速率很快，在合适的条件下，一定时期的大肠杆菌细胞每20min分裂一次。将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图，所绘制的曲线称为该

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