生物反应工程原理

共价结合法 共价键 纤维素，尼龙

交联法：利用双功能试剂，在酶分子间发生交联，凝胶形成网状结构。

包埋法：将酶包埋在凝胶的微细格子里，或被半透性的聚合膜所包埋，使酶分子只能从凝胶的网络中漏出，而小分子的底物和产物可自由通过。 格子型 常用凝胶：角叉菜胶，明胶，淀粉凝胶，聚丙烯酰胺凝胶 微胶囊

2.3.1.3 固定化对酶性质的影响

（1）底物专一性的改变 由于立体障碍，使的底物特异性发生改变。例如，胰蛋白酶既作用于高分子的蛋白质，又作用于低分子的肽或多肽。采用羧甲基纤维素对胰蛋白酶进行固定化后，胰蛋白酶对二肽或多肽的作用不变，但对酪蛋白的作用仅为游离酶的3％左右。

（2）稳定性增强 一般固定化酶比游离酶稳定性好，表现在热稳定性，保存和使用稳定性的增加，及对蛋白酶的抵抗性和耐受性增强。

（3）最适pH值和最适温度变化 酶固定化载体为多聚阳离子性质时，固定化酶的最适pH值向酸性一侧移动；酶固定化载体为多聚阴离子性质时，固定化酶的最适pH值向碱性一侧移动；产物为酸性时，固定化酶最适pH值向酶性一侧移动；产物为中性时，最适pH值一般无变化。

（4）动力学参数的变化 酶经固定化后，表观米氏常数发生变化。 2.3.1.4影响固定化酶促反应的主要因素

（1）分子构象的改变 指固定化过程中酶与载体的相互作用引起酶的活性中心或调节中心的构象发生了变化，导致酶与底物的结合力下降。

（2）位阻效应 由于载体的遮蔽作用或固定化方法不当，给酶的活性中心或调节中心造成空间障碍 ，使底物和酶无法与酶接触。

（3）微扰效应 由于载体的亲水性、疏水性、介电常数等性质，使酶所处的微环境与宏观环境不同，从而改变了酶的催化能力或酶对效应物的调节能力的效应。 （4）分配效应 由于载体与底物之间疏水性、亲水性或静电作用引起微环境和宏观环境之间物质的不等分配，从而影响酶促反应速率的一种效应 分配效应可用分配系数KP来定量描述。

Kp的定义：载体内外底物（或其他物质）浓度之比。

Kp的测定：在已知底物浓度CS0、体积V0的溶液中，放入不含底物的一定体积V’的载体，并保持适宜条件，当达到平衡时，测定载体外溶液的底物浓度CS。 (5) 扩散效应 由于底物、产物或其他效应物的迁移和传递速度所受到的限制，当物质扩散系数很低，酶活性较高时，在固定化周围形成浓度梯度，造成微观环境和宏观环境间底物、产物浓度产生差别。 扩散效应可定量描述。 2.3.2 固定化酶促反应中的过程分析 2.3.2.1 外部扩散过程

当固定化酶促反应受外部扩散限制时，固定化酶表面处底物浓度CSS小于主体溶液底物浓度CS，因此固定化酶促反应速率rout小于未固定化时的酶促反应速率ro。用外扩散效率因子?out表示外扩散对固定化酶促反应的影响。记作

?out?routrormaxCSSK?CSSCSS （2－83） ?m?rmaxCSKm?CSSKm?CS（CS??Km时，rout?ro）

可见，只要确定了固定化酶表面浓度CSS， 即可计算外扩散效率因子?out。那么，固定化酶表面底物浓度CSS又如何确定呢？

以表面固定化酶为例。主体溶液底物浓度为CS，载体外表面底物浓度为CSS。

外扩散速N=kLa(CS-CSS)，Nmax=kLaCS （2-84） 酶促反应 rout?CSS CS rmaxCSS （2-85）

Km?CSSrmaxCSS?kLa(CS?CSS) （2-86）

Km?CSS 达到平衡时，N?rout，即

由（2－86）式即可唯一确定CSS。

CSS也可用图解法确定。r~CS曲线与N~CS曲线交点即为(CSS，rout)。

0 CSS CS 0 CSS CS Nmax N，r rmax N，r Nmax (CSS，rout)

(CSS，rout) rmax 图2-9 图2-10

图2-9为rmax??Nmax的情况，此时CSS?0,?out?0；图2-10为

rmax??Nmax的情况，此时CSS?CS,?out?1。

Da?rmax，称为Da准数 Nmax

当Da?1时，CSS?0,?out?0，过程为外扩散控制。 当Da?1时，CSS?CS,?out?1，过程为反应控制。 令C*?CSSK（2-86）式可变形为： ,K?m，

CSCSrmaxC*?kLaCS(1?C*)?Nmax(1?C*) *K?C整理，得

rmaxrmax(1?C*)(K?C*) （2－87） Da???*NmaxkLaCSC上式表明C*为Da准数的函数，即C*?f(Da)。 令C*?CSSK（2－83）式可变形为 ,K?m，

CSCS?out?C* （2－88）

K?C*（2－88）式表明?out为C*的函数，即?out?g(C*)。

由此可知，Da准数是决定效率因子?out和比浓度C*的唯一参数，因而是表征传质过程对反应速率影响的基本准数。Da准数越小，固定化酶表面浓度越接近于主体浓度CS，?out越接近1。Da准数越大，固定化酶表面浓度越趋近于零，

?out越小，越趋近于零。

可见，为提高固定化酶外扩散效率，应设法减小Da准数。 从公式Da?rmax可知，减小Da准数的方法有两个，一是降低固定化酶kLaCS颗粒的粒径，增大比表面积a，但由于粒径减小会伴随压降增加，因此应用中综合考虑，确定合适的粒径；二是使固定化酶表面流体处于湍流状态以增大kL。 2.3.2.2 内部扩散过程

具有大量内孔的球形固定化颗粒，其内部是酶促反应的主要场所，底物通过孔口向内扩散，达到不同深度，产物沿反方向从内部向孔口扩散。颗粒内部各点处底物和产物浓度不同，导致各处的反应速率的差异。

内扩散效率因子?in的定义为单位时间内颗粒内部实际酶促反应速率rin与按颗粒外表面底物浓度计算而得到的反应速率ro之比。记作

?in?rin (2-89) ro为获得固定化酶颗粒内部实际反应速率rin，就要首先确定颗粒内部底物浓度分布。

dr

r

R

图2－ 多孔球形固定化酶颗粒内的物料衡算

对球形固定化颗粒，半径为R，在距中心处为r处取一厚度为dr的微元壳体，在微元壳体内，底物浓度CSr，稳定状态下，对底物S进行物料衡算：

流入量－流出量＝反应量

?dC??dC?4?(r?dr)2De?Sr??4?r2De?Sr??4?r2rSdr?dr?r?dr?dr?r(2-90)

整理，得

?dC??dC?4?[r2?2rdr?(dr)2]De?Sr??4?r2De?Sr??4?r2rSdr

?dr?r?dr?dr?r??dC??dC???dC?4?r2De??Sr???Sr???8?rdrDe?Sr??4?r2rSdr

?dr?r?dr??dr?r?dr?dr?r?两侧同除4?r2Dedr，得