生产菌种的扩大培养与保藏

表7-1 不同相对湿度对龟裂链霉菌斜面生长的影响

相对湿度（%）

16.5~19 25~36 40~45

3，培养时间和冷藏时间 （1）培养时间

一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢子，因为衰老的孢子已在逐步进入发芽阶段，核物质趋于分化状态。过于衰老的孢子会导致生产能力的下降。

解决措施：

孢子培养的时间应该控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养。

（2）冷藏时间

斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关。如土霉素生产菌种孢子斜面培养4天左右即于4℃冰箱保存，发现冷藏7~8天菌体细胞开始自溶。而培养5天以后冷藏，20天未发现自溶。

冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。例如在链霉素生产中，斜面孢子在6℃冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低18%，冷藏3个月后降低35%。

4，接种量

接种量大小影响到培养基中孢子的数量，进而影响菌体的生理状况。

二、影响种子质量的因素及控制

生产过程中影响种子质量的因素通常有：孢子的质量、培养基、培养条件、种龄、接种量。

1，培养基

种子培养基要满足以下要求： （1）营养成分适合种子培养的需要

（2）选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基； （3）营养上要易于被菌体直接吸收和利用；

（4）营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量要高 （5）营养成分要尽可能与发酵培养基相近。 2，培养条件

斜面外观

上部稀薄、下部稠略黄 上部薄、中部均匀发白 一片白，孢子丰富，稍皱

活孢子计数（亿/支）

1.2 2.3 5.7

（1）温度

（2）通气量

在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用的培养基外，有足够的通气量可以提高种子质量。例如，青霉素的生产菌种在制备过程中将通气充足和不足两种情况下得到的种子分别接入发酵罐内，它们的发酵单位可相差1倍。但也有例外，例如土霉素生产菌，一级种子罐的通气量小对发酵有利。

3，种龄

种龄：是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。

通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期，菌体量还未达到最大值时的培养时间较为合适。时间太长，菌种趋于老化，生产能力下降，菌体自溶；种龄太短，造成发酵前期生长缓慢。

不同菌种或同一菌种工艺条件不同，种龄是不一样的，一般需经过多种实验来确定。如嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，12小时最好（见下图）。

4，接种量

接种量：是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。

接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂

菌的生长机会。但接种量过大或者过小，均会影响发酵。过大会引起溶氧不足，影响产物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经济；过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。

通常接种量，细菌1~5%，酵母菌5~10%，霉菌7~15%，有时20~25%

三、种子质量的控制措施

种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的生产能力。因此首先必须保证生产菌种的稳定性，其次是提供种子培养的适宜环境保证无杂菌侵入，以获得优良种子。因此在生产过程中通常进行以下两项检查。

（1）菌种稳定性的检查 （2）无（杂菌）检查

四、种子质量标准

1，细胞或菌体

菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（色素、颗粒等）

单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态； 霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好。

2，生化指标

种子液的糖、氮、磷的含量和pH变化。 3，产物生成量

在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。

4，酶活力

种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定的关联。

五、种子异常分析

菌种生长速度，过快或过慢 菌丝结团 菌丝粘壁

第三节 实例

一、谷氨酸发酵的菌种扩大培养

斜面菌种→一级种子培养→二级种子培养→发酵罐 1，斜面菌种的培养

菌种的斜面培养必须有利于菌种生长而不产酸，并要求斜面菌种绝对纯，不得混有任何杂菌和噬菌体，培养条件应有利于菌种繁殖，培养基以多含有机氮而不含或少含糖为原则。

(1)斜面培养基组成

葡萄糖 0.1%，蛋白陈 1.0%，牛肉膏 1.0%，氯化钠 0.5%，琼脂 2.0~2.5%，pH 7.0~7.2（传代和保藏斜面不加葡萄糖）。

(2)培养条件

33~34℃，培养18~24h。 2，一级种子培养

一级种子培养的目的在于大量繁殖活力强的菌体，培养基组成应以少含糖分，多含有机氮为主，培养条件从有利于长菌考虑。

(1)培养基组成

葡萄糖 2.5%，尿素 0.5%，硫酸镁 0.04%，磷酸氢二钾 0.1%，玉米浆 2.5~3.5%(按质增减)，硫酸亚铁、硫酸锰各2ppm，pH7.0。

(2)培养条件

用1000mL三角瓶装入培养基200mI，灭菌后置于冲程7.6cm、频率96次/min