种子的扩大培养及染菌的检测

种子的扩大培养及染菌

的检测

指导教师：乔宏萍

专业: 生物技术 班级: 103班 相关实验课程名称: ＿＿微生物工程学实验＿ 实验学期 2012-2013 学年 一 学期

种子的扩大培养及污染的检测和判别

摘要 目的 学习菌种扩大培养方法；了解发酵染菌的危害；学习检测发酵污染的基本方

法。 方法 用斜面培养基进行菌种的活化，营养培养基进行菌种的扩大培养。发酵过程中，采用了染色镜检、平板检测以及肉汤培养检测相结合的方式进行杂菌检测。 结果 镜检时，多个视野中均观察到了大肠杆菌，没有观察到球菌或其他的细菌，因此可初步认为该种子液中没有感染杂菌。从营养琼脂培养基上长出的菌落的形态上看，有不同形态的菌落，可简单说明菌液中污染杂菌或接种时造成污染。在肉汤法检测中，没有发现肉汤变浑浊，也可观察无颜色变化时可以判断培养基灭菌彻底。

关键词 营养培养基 扩大培养 污染

前言 现代发酵工业的生产规模越来越大，发酵罐容积已达到几十立方米或几百立方米。因此要在短时间内完成发酵，必须数量巨大的微生物才行，如按百分之十左右的种子量计算，就要投入几立方米。所以要从保藏在试管逐级扩大为生产用种子。种子扩大培养的任务就是要获得适量足够的健壮的微生物。

微生物工业发酵过程中，为提高其产率及质量，要采用纯种发酵。发酵污染可发生在各个时期，种子培养期染菌的危害最大，应严格防止。一旦发现种子污染，均应灭菌后弃去，并对种子罐及其管道进行彻底灭菌。因此,纯种的制备及污染检测是重要的一道工序。在发酵过程中随时检测染菌，对减少杂菌污染造成的损失至关重要。现在常用的检测方法是：细胞形态的对比、菌落形态的对比、微生物生长浊度观察、发酵参数判断。 1 材料

1.1 材料 菌种：大肠杆菌

1.2 仪器 高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、带摇床的培养箱 1.3 用品 显微镜、三角瓶、试管、 接种针、酒精灯

1.4 试剂 葡萄糖、磷酸二氢氨、七水合硫酸镁、氯化钠、磷酸氢二钾、营养琼脂、牛肉膏、蛋白胨、0.4%酚红溶液、蒸馏水、番红

1.5 培养基 ⑴营养琼脂培养基：直接称量营养琼脂粉 ，配制200mL，pH7.2。分装试管，灭菌后摆成斜面。 ⑵种子培养基：葡萄糖0.5%、磷酸二氢氨0.1%、七水合硫酸镁0.02%、氯化钠0.5%、磷酸氢二钾0.1% ⑶肉汤培养基：牛肉膏0.3%、

蛋白胨0.8%、葡萄糖0.5%、氯化钠0.5%、0.4% 酚红溶液，pH7.2. 2 方法

2.1 种子的扩大培养

2.1.1 灭菌 将上述配置好的培养基，实验所需的玻璃仪器——培养皿、移液管，加塞三角烧瓶、试管等放于高压蒸汽灭菌锅中，在121oC条件下灭菌30min。 2.1.2 菌种的活化

2.1.2.1将大肠杆菌采用无菌操作的方法接种于斜面上，37oC培养18h。 2.1.2.2培养18h后，观察菌落颜色是否一致，若均为黄色，挑取培养皿周边的菌落进行无菌检测；若颜色有黄有白，则两种颜色的菌落均要进行无菌检测。 检测方法常用染色镜检，若检测后，没有污染，便可进行扩大培养；若检测到杂菌，要重复上述步骤，直到无菌为止，否则，不能继续下一步操作。

2.1.3 扩大培养 在无菌条件下，从检测后的活化培养基上选取10个菌落，用接种针接种到扩大培养基中，于37oC下培养16-18h，观察菌落形态。然后配合显微镜形态观察。根据结果来判断能否进行下一步。 2.2污染的检测和判别 2.2.1 显微镜检查

2.2.1.1取样：用无菌操作方式取发酵液少许,涂布在载玻片上；

2.2.1.2制片、染色：自然风干后,用番红或草酸铵结晶紫染色1-2min，水洗； 2.2.1.3干燥后用油镜下观察。 2.2.2平板检查

2.2.2.1配制营养琼脂培养基，灭菌，倒平板；

2.2.2.2取少量待检发酵液经稀释后(大约10–6～10–7)涂布在营养琼脂平板上，在37oC下培养24h； 2.2.2.3观察菌落形态。 2.2.3 肉汤培养检测

2.2.3.1 配置葡萄糖酚红肉汤培养基

2.2.3.2 将上述培养基灭菌后，置于37oC培养24h，若培养液未浑浊，则可继续接种，进行杂菌检测。 3 结果及分析

3.1种子的扩大培养 在活化培养基上长出大量菌落，且菌落颜色单一，均为黄色。挑取边缘菌落及形态一致的菌落少量，制作装片，染色后在显微镜下观察，发现多个视野中都为杆菌，可初步鉴定出活化的菌种中没有污染杂菌。选取没有污染杂菌的菌落，用无菌操作技术接种，进行扩大培养。 在适宜条件下培养16h后，得到了大肠杆菌的种子液。

3.2显微镜检查 镜检时，多个视野中均观察到了大肠杆菌，没有观察到球菌或其他的细菌，因此可初步认为该种子液中没有感染杂菌。但也可能是由于吸取的菌液量有限，而且观察的视野较小，杂菌数本身也少，导致没有观察到。因此，为了更准确的检查菌液中是否由杂菌，还需进一步实验来证明。

3.3平板检查 从营养琼脂培养基上长出的菌落的形态上看，平板上有许多不同形状的菌落，有较多杂菌污染，只有一个生长较为良好，形成许多单个菌落。所以判断造成平板污染可能不是菌液中有杂菌，而是由于在超净工作台中稀释、涂平板时操作不当造成了杂菌污染。但单凭长出单一菌落的平板业不能完全就肯定菌液没有污染，可能是由于大肠杆菌为优势菌种，限制了杂菌的生长，因此杂菌的菌落较小，用肉眼看不到。为了进一步确证，可配合显微镜形态观察，若个体形态与菌落形态都与生产菌一样，则可确认没有污染杂菌；否则污染了杂菌。

3.4肉汤检验 将培养液接入肉汤中培养后，未见肉汤培养基变浑浊，颜色也无变化，则可确证该培养基灭菌彻底，没有污染杂菌。若在以后的培养液中发现有杂菌存在，则可排除是由于培养基灭菌不彻底，而造成了污染，可能是由于接种时操作不规范，而导致杂菌污染。 此方法主要用于空气过滤系统的无菌检测，还可用于检查培养基灭菌是否彻底，只需少量培养基接入肉汤中，培养后看肉汤的混浊程度，有时也可看颜色变化。

结论

在对菌种纯度进行检测时一般有显微镜检查、平板检查和肉汤培养法三种。 显微镜检测由于菌体较小，本身又处于非同步状态，应注意不同生理状态下生产菌与杂菌的区别，且对含杂菌少的样品不易得出正确的结论，应多检查几个视野。其次，对固形物多的发酵液检查较困难。在显微镜检测中，若观察到没有区别于目的菌的其他杂菌时不能直接判断无杂菌污染，因为也可能是吸取的菌液量有限还需进一步实验来证明。平板检查则适合于固形物较多的发酵液检测，形象直观，

肉眼可辨。但也会由于大肠杆菌是优势菌种而导致其他杂菌菌落较小，因此，为了进一步确证，可配合显微镜形态观察，若个体形态与菌落形态都与生产菌一样，则可确认没有污染杂菌，否则污染了杂菌。肉汤培养法只可用来检测培养基的灭菌是否彻底。在肉汤法检测中，没有发现肉汤变浑浊，也可观察无颜色变化时可以判断培养基灭菌彻底，因此在以后发酵过程中若出现杂菌污染则可排除培养基灭菌不彻底引入了杂菌。 通过本实验我们了解了种子制备的方法以和发酵染菌的危害、学习检测发酵污染的基本方法。

染菌后轻者影响产率、产物提取收得率和产品质量，重者造成“倒罐”，不但浪费了大量原材料，造成严重的经济损失，而且污染了环境。在发酵过程中，我们应根据菌种的生理特性，选择合适的种子扩大培养条件，来获得代谢旺盛、数量足够的种子。优良种子可以缩短生产周期、稳定产量、提高设备利用率。发酵过程中及早发现杂菌并采取相应措施，对减少由杂菌污染造成的损失至关重要。

参考文献

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