第六讲 基因克隆的质粒载体

图 寡聚体对pBR322稳定性的效应

在寄主菌株rec下中，pBR322以单体形式存在，因此十分稳定，经过160世代之后含有pBR322的细胞仍为百分之百；而在sbcA菌株pBR322发生了广泛的寡聚化效应，经过80世代之后，含质粒的细胞便下降到16%左右。

4．随机分配的分子机理

天然高拷贝数的质粒都相当稳定(此点与重组质粒载体明显不同)。这类高拷贝数天然质粒在细胞分裂过程中，都是随机分配的。维持随机分配的天然质粒稳定性的分子机理包括如下几个主要的方式：

(1)控制环路机理

通过精巧的控制环路使质粒拷贝数的差度限制在最低的水平，这是维持随机分配的天然质粒稳定性的一种有效方式(机理)。 如前有关ColE1质粒复制控制所述：

RNAI和RNAII是由ColE1同一区段序列之正反链编

码的，因此两者序列可以互补；

Rom蛋白质是由质粒rom基因编码的DNA复制阻遏

物，它可使RNAI和RNAII结合得更加稳定。

副反馈环路：

RNAII又叫复制引物，它同质粒复制起点上游DNA结合成RNAII/DNA双链分子

↓

经RNaseH切割释放出3-OH作为合成DNA的引物 质粒开始复制

↓

RNAI可以同RNAII结合阻止其形成RNAII-DNA双链体分子，而Rom蛋白质又可促进并稳定这种结合作用，质粒停止复制。

因此当细胞中质粒拷贝数下降到正常值以下时，→RNAI水平下降，→解离了与RNAII的结合，→质粒开始复制→RNAI和Rom上升→抑制质粒复制??。

(2)位点特异重组机理

通过位点特异的重组作用，消除天然质粒的寡聚体，也是维持随机分配的天然质粒稳定性的一种有效方式。

在许多高拷贝数的质粒中，都已鉴定出了寡聚体解离位点cer，该位点的功能是参与位点特异的分子内重组，使质粒寡聚体转变成单体分子。

在能够形成质粒寡聚体的大肠杆菌sbcA菌株中：

a. 无cer位点的ColE1突变体(cer-)，经100世代无质粒细胞可高达40%；

b. 具cer位点的ColE1质粒(cer+)，经100世代之后，则仍然保持稳定；

图4-35 质粒寡聚体解离位点cer的功能作用

由同源重组形成的ColE1质粒寡聚体，通过cer位点特异的分子内重组转变成单体

质粒分子中的cer，是寡聚体解离位点

↓

cer的启动子指导Rcd转录本合成

↓

超量表达的Rcd会抑制寄主细胞分裂

↓

含寡聚体质粒的细胞中，cer转录活性加强

↓

Rcd过表达的结果

↓ 抑制细胞分裂

↓

避免无质粒细胞产生

↓ 质粒稳定

(3)细胞分裂调节机理

在cer位点中的启动子，会指导合成一种短小的Rcd转录本，当其超量表达时就会抑制大肠杆菌寄主细胞的分裂。