第六讲 基因克隆的质粒载体

同的方式：主动分配(active partition)和随机分配(random distribution)。

主动分配方式，包括①平均分配机理，它使每个子细胞刚好获得一半数目的质粒拷贝。②配对位点分配机理，它认为只有一对质粒呈主动分配，其余的是随机分配。由于主动分配存在着有效的质粒拷贝数控制系统，从而保证了质粒的高度稳定性。

随机分配方式，它是指在细胞分裂过程中，质粒拷贝数在两个子细胞之间是随机分配的。由此产生的分离频率，即形成无质粒细胞的频率相当低，因此，在一般情况下，通过随机分配质粒亦可得到稳定的遗传。

3．影响质粒稳定性的因素：a.新陈代谢负荷；b.拷贝数差度；c.寄主

重组体系；

(1)新陈代谢负荷对质粒载体稳定性的效应。 质粒对寄主的影响：

a.加重寄主细胞的新陈代谢负荷；

b.延长寄主细胞的世代时间(达15%)；克隆的外源DNA片段越大，寄主细胞的世代时间也就越长；

正是由于上述这些原因，使得含有质粒载体的寄主细胞加重了代谢的负荷，降低了生长速度。

因此，尽管在细胞分裂过程中，因随机分配而产生的无质粒载体细胞的机率相当低，但由于这些细胞生长速度快，经过初始的缓慢积累之后，最终便会取代具质粒载体的细胞成为培养物中的优势群体。

(2)拷贝数差度对质粒载体稳定性的影响

*1.在大肠杆菌培养物中，产生无质粒载体细胞的速率，是由分裂细胞中的质粒拷贝数决定的。不过这里有必要指出，文献中所说的质粒载体拷贝数，是实验测定的大量细胞的平均值，它并不反映细胞群体中质粒载体拷贝数分布的客观无能为动态。

*2.质粒载体拷贝数差度：事实上在同样的细胞培养物中，每个细胞所拥有的质粒载体拷贝数是不尽相同的。这种不同细胞个体之间的质粒载体拷贝数的差异程度，简称差度(variance)。 *3.质粒差度可影响质粒载体丢失的速率，也是造成质粒载体不稳定性的原因之一：

具高差度分布的质粒载体，其稳定性就比较差，这是

因为位于低拷贝数的一端，产生无质粒载体细胞的频率相当高；

具氏差度分布的质粒载体，其稳定性就相当高。

图

(3)寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应 *1.质粒寡聚体(plasmid oligomer)

在野生型的大肠杆菌细胞中，质粒间的重组的结果会形成质粒寡聚体，而且事实表明含有大片段插入的质粒载体的寡聚化作用，是普遍存在的问题，它同样也是造成质粒载体不稳定性的原因之一。

*2.决定含质粒寡聚体细胞比例的因素。

决定在大肠杆菌培养物中，含有质粒寡聚体细胞比例的因素有两点：

其一是质粒DNA分子间的重组频率； 其二是含质粒寡聚体细胞的生长速率；

*3.二聚体灾难(dimmer catastrophe)

重组的质粒二聚体一旦形成，便会以高出质粒单体分子两倍的速率进行复制，从而导致出现质粒寡聚体的克隆增殖，即所谓的二聚体灾难。

*4.质粒二聚体灾难的清除。由于大肠杆菌细胞中存在着某种目前我还不知道的机理，使含有二聚体的细胞生长速度下降，并最终使细胞群体中含质粒二聚体的细胞的比例达到平衡的状态。

*5.寄主细胞类型对质粒稳定性的影响

影响质粒重组的突变同样也会影响质粒的稳定性。例如在重组缺陷的(rec-)大肠杆菌寄主细胞中，pBR322和pUC，当其以单体形式存在时表现得最为稳定，而随着质粒寡聚体比例的逐渐上升，其稳定性也就相应地下降。