实验五 培养基的制作及灭菌

08水产养殖 学号：060122008062 姓名:韦海明

实验五 培养基的制作及灭菌

一 实验目的

1 学习培养基的配制原理和一般方法步骤 2 掌握高压蒸汽灭菌的原理方法 3 了解干热灭菌的原理方法

二 实验原理

1 培养基的原理

培养基（medium）是用人工的办法将多种营养物质按微生物生长代谢的需要配制成的一种营养基质。由于微生物种类繁多，对营养物质的要求各异，加之实验和研究的目的不同，所以培养基在组成成分上也各有差异。但是，不同种类或不同组成的培养基中，均应含有满足微生物生长发育且比例合适的水分、碳源、氮源、无机盐、生长因素以及某些特需的微量元素等。配制培养基时不仅需要考虑满足这些营养成分的需求，而且应该注意各营养成分之问的协调。

按照配制培养基的营养物质来源，可将培养基分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基三类 .

按培养基外观的物理状态可将培养基分成三类，即液体培养基、固体培养基和半固体培养基 .

按照培养基的功能和用途，可将其分为基础培养基、加富培养基、选择培养基、鉴别培养基等 .

牛肉膏蛋白胨培养基是细菌学研究最常用的天然培养基。在配方中不加琼脂时称之为肉汤培养基。加入琼脂配制的固体培养基一般用于细菌的分离、培养和计数等.

2 灭菌的原理

1) 干热灭菌

用干燥热空气杀死微生物的方法称为干热灭菌。通常将灭菌物品置于鼓风干燥箱内，在160℃～170℃加热1～2h。灭菌时间可根据灭菌物品性质与体积作适当调整，以达到灭菌日的。玻璃器皿（如吸管、培养皿等）、金属用具等凡不适于用其他方法灭菌而又能耐高温的物品都可用此法灭菌；但是，培养基、橡胶制品、塑料制品等不能使用干热灭菌。 注意事项：

1）灭菌的玻璃器皿切不可有水。有水的玻璃器皿在干热灭菌中容易炸裂。 2）灭菌物品不能堆得太满、太紧，以免影响温度均匀上升。

3）灭菌物品不能直接放在电烘箱底板上。以防止包装纸或棉花被烤焦。

4）灭菌温度恒定在160～170℃为宜。温度超过180℃棉花、报纸会烧焦甚至燃烧。

5）降温时，需待温度自然降至60℃以下才能打开箱门取出物品，以免因温度过高而骤然降温导致玻璃器皿炸裂。 2) 湿热灭菌

1

08水产养殖 学号：060122008062 姓名:韦海明

湿热灭菌法比干热灭菌法更有效。湿热灭菌是利用热蒸汽灭菌。在相同温度下，湿热的效力比干热灭菌好的原因是：1）热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强。水分子的存在有助于破坏维持蛋白质三维结构的氢键和其他相互作用弱键，更易使蛋白质变性。蛋白质含水量与其凝固温度成反比；2）热蒸汽比热空气穿透力强，能更加有效地杀灭微生物；3）蒸汽存在潜热，当气体转变为液体时可放出大量热量，故可迅速提高灭菌物体的温度。 分为常压蒸汽灭菌和高压蒸汽灭菌. 高压蒸汽灭菌 灭菌原理

高压蒸汽灭菌是在密闭的高压蒸汽灭菌器（锅）中进行的。其原理是：将待灭菌的物体放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内。把锅内的水加热煮沸，并把其中原有的冷空气彻底驱尽后将锅密闭。再继续加热就会使锅内的蒸汽压逐渐上升，从而温度也随之上升到100℃以上。为达到良好的灭菌效果，一般要求温度应达到121℃（压力为0.1MPa），时间维持15～30min。也可采用在较低的温度(115℃，即0.075Mpa)下维持30min的方法。 手提式灭菌锅使用要点 （1）加水 使用前在锅内加入适量的水，加水不可过少，以防将灭菌锅烧干，引起炸裂事放。加水过多有可能引起灭菌物积水。

（2）装锅 将灭菌物品放在灭菌桶中，不要装得过满。盖好锅盖，按对称方法旋紧四周固定螺旋，打开排气筏。

（3）加热排汽 加热后待锅内沸腾并有大量蒸汽自排气阀冒出时，维待2一3min以排除冷空气。如灭菌物品较大或不易透气。应适当延长排气时间，务必使空气充分排除，然后将排气间关闭。

（4） 保温保压 当压力升至 0.1MPa时，温度达 121℃，此时应控制热源。保持压力，维持20min后，切断热源。

（5）出锅 当压力表降至“0”处，稍停，使温度继续降至100℃以下后，打开排气阀，旋开固定螺旋，开盖取出灭菌物。注意。切勿在锅内压力尚在“0” 点以上，温度也在100℃以上时开启排气阀，否则会因压力骤然降低，而造成培养基剧烈沸腾冲出管口或瓶口，污染棉塞，以后培养时引起杂菌污染。

（6） 保养 灭菌完毕取出物品后，将锅内余水倒出，以保持内壁及内胆干燥，盖好锅盖。

三 实验器材

1 药品和试剂：牛肉膏、蛋白胨、NaCl 、 1NHCl、1NNaOH溶液。

2 器材：小烧杯、1000mL不锈钢杯、电炉、天平、牛角匙、玻棒、pH试纸、试管、分装漏斗、棉塞、三角瓶、橡皮圈。 3 高压灭菌锅

四 实验方法

1 在1000mL不锈钢烧杯中加入500mL水,用玻棒标记液面(定容用),将水倒掉.

2 在100mL 小烧杯中称取牛肉膏2.5g、蛋白胨 5.0g，加 25mL自来水，置电炉搅拌加热至牛肉膏、蛋白胨完全溶解。

3 向不锈钢杯中加人250mL自来水，将溶解的牛肉膏、蛋白胨倒入不锈钢杯中并用自来水洗2～3次。加入2.5gNaCl，在电炉上边加热边搅拌。

2

08水产养殖 学号：060122008062 姓名:韦海明

4 药品完全溶解后, 加入自来水定容至500mL,用玻棒沾少许液体，测定pH值。用NaOH或HCI调至pH7.4.

5 用量筒将培养基分成400mL 和100mL两部分.

6 将8g琼脂粉加入到400mL培养基中，搅拌，加热至琼脂完全熔化．

7 将培养基趁热用注射器分装于18mmX 180mm试管中，每组分装１０只。盖上试管帽，牛皮纸包扎，待灭菌．

8 将剩余培养基装入 ５00mL的三角烧瓶中，盖上合适的棉塞，报纸包扎．待灭菌．

9 剩余的100mL培养基单数组同学配制液体培养基，将培养基在烧杯中煮沸１０分钟，过滤, 补足水，分装1６mmX 1６0mm试管１０只，盖上试管帽，牛皮纸包扎，待灭菌． 10 双数组同学将0.5g琼脂加入到100mL培养基中,搅拌，加热至琼脂完全熔化．分装1６mmX 1６0mm试管１０只，盖上试管帽，牛皮纸包扎，待灭菌．

11 配制150mL生理盐水(0.85% NaCl水溶液), 用量筒量取100mL装于250mL的三角烧瓶中,再用移液管取出1mL, 加棉塞,用报纸包扎, 制成99mL稀释水; 用移液管移取9mL生理盐水,分装于18mmX 180mm试管中, 分装四只.

12 将培养基和稀释水及枪头等标记好进行高压蒸汽灭菌，在121℃灭菌20min. 13 灭菌后摆放斜面,其余培养基及仪器放于实验台存放。

注: 试管分装量, 液体---试管高的1/4到1/3; 固体---试管高的1/5; 半固体---试管高的1/3; 三角瓶---瓶高1/2左右.

五 思考题

1 培养基配好后,为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是无菌的?

答：如果不立即灭菌，有可能受到其他微生物的污染，并且消耗培养基中的营养物质。现取出一部分培养基，放置在培养箱中培养一段时间，观察是否有细菌生长来判断有无菌。

2 培养微生物的培养基应具备哪些条件?为什么?

答:培养微生物的培养基应具备的条件有： ①?? 足够的营养，包括碳源，氮源，能源物质，生长因子，无机盐，水，提供微生物生

长所需的物质条件，保证微生物的正常生长；

② 适当pH值，根据不同的微生物创造不同的pH环境，并借助磷酸缓冲液及CaCO3备用碱维持培养基的pH值；

③ 适度的渗透压和水，渗透压相等的等渗溶液最适合微生物生长，高渗溶液会使细胞质壁分离，低渗溶液则会使细胞吸水膨胀，水适度表示天然或人为环境中，微生物可实际利用的自由水或游离水的含量，其定量涵义为，在同温同压下，某溶液的蒸气压与纯水蒸气压之比，因此aw也等于该溶液的百分相对湿度值，各微生物生长繁殖范围的aw值在0.998—0.60之间； ④适当温度，创造微生物培养最适温度。 3 pH为什么调过头再回调不好?

答：因为回调会影响培养基内各离子的浓度，使得培养基中的无机物含量增加，增大培养基的渗透压，使一些微生物无法生长。

4 为什么分装过程中不要使培养基沾在管口或瓶口上?

答：因为若培养基沾在管口或瓶口上会玷污棉塞引起污染。 5 为什么液体培养基要过滤?为什么过滤前要先加热煮沸?

答：液体培养基中含有不溶杂质，不经过滤，杂质可能导致观察和鉴定微生物时产生误

3

08水产养殖 学号：060122008062 姓名:韦海明

导。过滤前加热煮沸是为了让所需的培养基充分溶解，以免过滤时也把它过滤掉。 6 为什么干热灭菌比湿热灭菌所需温度高时间长?

答：干热灭菌和湿热灭菌都是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性从而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越少，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需的温度高，时间长。

7 高压蒸汽灭菌开始之前,为什么要将锅内冷空气排尽? 答：因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度小于饱和蒸汽温度。也正因为湿热蒸汽有潜热的存在，才能使其迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。所以使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要。

8 灭菌完毕后,为什么要在压力降到零时,才能打开排气筏取物?

答： 因为如果压力未降到0，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者。

9 在使用高压蒸汽锅灭菌时,怎样杜绝一切不安全因素? 答：

①首先将内层锅取出，再向外层锅加入适宜的水，使水面与三角搁架相平为宜。切忌忘记加水，同时加水量不能太少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。

②在用电炉或煤气加热时，要同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。

③灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降到“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物。压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因为压力未降到0，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者。

4