实验一 醋酸纤维薄膜电泳分离核苷酸

实验一 醋酸纤维薄膜电泳分离核苷酸

一. 目的

学习核糖核酸碱水解的原理和方法，掌握核糖核苷酸的醋酸纤维薄膜电泳的原理和方法。

二. 原理

RNA在稀碱条件下水解，先形成中间物2＇，3＇-环状核苷酸，进一步水解得到2＇和3＇-核苷酸的混合物。

在PH3.5时，各核苷酸的第一磷酸基（PK0.7－1.0）完全解离，第二磷酸基（PK6.0）和稀醇基（PK9.5以上）不解离，而含氮环的解离程度差别很大。（见附表）因此在PH3.5条件下进行电泳可将这四种核苷酸分开。

四种核苷酸在PH3.5时的离子化程度：

核苷酸 AMP GMP CMP UMP 含氮环的PK值 3.70 2.30 4.24 － 离子化程度 0.54 0.05 0.84 净负电荷 0.46 0.95 0.16 1.00 本实验先用稀氢氧化钾溶液将RNA水解，再加高氯酸将水解液调至PH3.5，同时生成高氯酸钾沉淀以除去K+,然后用电泳法分离水解液中各核苷酸，并在紫外分析灯下确定RNA碱水解液的电泳图谱。

三. 仪器、试剂、材料

1. 仪器

电热恒温水浴锅；紫外分析灯（波长为254nm）点样器；离心机；电泳仪和电泳槽 2. 试剂

100ml 0.3mol/L氢氧化钾溶液；40ml 200g/L高氯酸溶液；4g核糖核酸（粉末）；1000ml 0.02mol/L PH3.5 柠檬酸缓冲液； 3. 材料

醋酸纤维薄膜（2×8cm）

四. 操作方法

1. RNA的碱水解：

称取0.2g RNA，溶于5ml 0.3mol/L氢氧化钾溶液中，使RNA的浓度达到20－30mg/ml。在37度下保温18小时（或沸水浴30分钟）。然后将水解液转移到锥形瓶内，在水浴中用高氯酸溶液滴定到水解液的PH为3.5。2000转/分离心10分钟，除去沉淀，上清液即为样品液。 2. 点样

将醋酸纤维薄膜在PH3.5 0.02mol/L柠檬酸缓冲液中浸湿后，用滤纸吸去多余的缓冲液。然后将膜条无光泽面向上平铺在玻璃板上，用电样器在距膜条一端2－3cm处点样。 3. 电泳

将点好样的薄膜小心地放入电泳槽内，注意点样的一端应靠近负极。调节电压至160V，电流强度为0.4mA/cm,电泳25分钟。

五. 结果处理

电泳后，将膜条放在滤纸上，紫外分析灯下观察，用铅笔将吸收紫外光的暗斑圈出。

在记录本上绘出RNA水解液的醋酸纤维薄膜电泳图谱，并根据附表中的数据分析确定各斑点代表哪种核苷酸。

六. 注意事项

1. 点样时，在膜条无光泽面点样，且点样量要适中。

2. 电泳时，膜条的点样端要靠近负极。

七. 思考题

1. 为什么点样要点在膜条无光泽的一端？

2. 为什么在PH3.5时进行电泳分离核苷酸的效果最好？醋酸纤维薄膜电泳分离核苦酸

参考文献

刘卫群，陈建新，吴鸣建主编．基础生物化学．北京：气象出版社，2000