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WB实验基本步骤

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  • 2025/7/11 2:41:58

实验基本步骤

提取细胞蛋白

↓ BCA定量

制备蛋白胶(SDS-PAGE胶)

蛋白样品变性

↓ 电泳 ↓ 转膜 ↓ 封闭 ↓ 一抗 ↓ TBST洗涤

↓ 二抗 ↓ TBST洗涤

↓ 显影 ↓ 结果分析

试剂配制

1.PBS磷酸盐缓冲溶液1L

磷酸二氢钾 0.24g 磷酸氢二钠 1.44g 氯化钠 8g 氯化钾 0.2g

加入500ml纯水,调PH=7.2 定容至1L,高压蒸汽灭菌

2.PBST(PBS+0.05%吐温-20)

500mlPBS+0.25ml吐温-20

3.电转液500ml

Tris 1.5g 甘氨酸 7.2g 400ml水溶解

加入100ml甲醇,置于4℃冰箱预冷

4.电泳液(1X)

10x稀释,50ml10x电泳液+450ml纯水

5.TBS

6.TBST(TBS+0.05%吐温-20)

50mlTBS+450ml纯水+0.25ml吐温-20

7.封闭液

TBST1X+5%奶粉

40ml封闭液=40mlTBST+2g奶粉,40℃预热

WB实验

一、蛋白样品制备

准备:一管细胞,PBS(4℃预冷),PMSF(100mM),移液枪(1000ul,10ul),1.5mlEP管2个,高速冷冻离心机4℃预冷

1.于-20℃冰箱中取出一管细胞样品,吸去培养液

2.加入1ml 4℃预冷的PBS(0.01M pH7.2~7.3)。用移液枪轻轻吹成悬浮液后4℃,8000r离心5min,然后弃去上清。重复以上操作一次,共洗细胞两次以洗去培养液。

3.按1ml裂解液加10 μl PMSF(100 mM),摇匀置于冰上。(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。) 4.在样品中加入300ul含PMSF的裂解液,吹匀,于冰上裂解30 min,为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

5.裂解完后,于4℃下12000 rpm离心5 min。

7.将离心后的上清分装转移倒0.5 ml的离心管中放于-20℃保存。

二、 蛋白含量的测定(BCA定量)

准备:96孔板,移液枪(1000ul,10ul,200ul),BCA工作液(A+B),50mlEP管,1xPBS,BSA标准液 1.将96孔板分好区域,若不够分则只做两个重复,(外围一圈的孔最好不用)

2.算好孔数(总的)每孔加200ulBCA工作液(A+B),(A液:B液=50:1,一般配多些,如60孔,A液12000ul,B液240ul)

3.将样品稀释到一定倍数才能定量,(10倍,20倍,30倍),每孔需要20ul样品(2ul样品+18ulPBS,即稀释10倍),做三个重复则需要60ul,一般配80ul

4.配蛋白标准样品,将2mg/ml的蛋白标准溶液稀释至0.5mg/ml,若配200ul 的0.5mg/ml蛋白标准溶液则需要50ul的2mg/ml的蛋白标准溶液和150ul PBS溶液

5.将稀释好的样品加入孔板中(标记的区域),接着标准品按0,1,2,4,8,12,16,20ul加到标号的区域,之后在加标准样品的孔内,将孔内溶液用PBS补足到20ul 6.每孔加200ul配好的工作液,平行加,不能上下加,以减少误差 7.将加好的96孔板放在37℃下孵育30分钟

8.孵育完后,放在酶标仪轻微震荡3-10s,中速,吸光值595nm,进行比色测定,记录标准曲线及样品吸光值数据后,以蛋白含量(ml)为横坐标,吸光值为纵坐标作标准曲线。(R2 >0.98才有用,酶标仪操作:两个箭头图标,1是结果,2是保存)

9.计算蛋白含量(注意定量样品已经稀释了10倍)

序号

标准蛋白量/ul (0.5mg/ml) 背景液(PBS)/ul 标准液浓度mg/ml

1 0 20 0

2 1 19 0.025

蛋白质定量标准曲线加样量 3 2 18 0.05

4 4 16 0.1

5 8 12 0.2

6 12 8 0.3

7 16 4 0.4

8 20 0 0.5

三、SDS-PAGE电泳

1. 配胶(12%,可以提前配好)

准备:玻璃板,梳子,AP(解冻,现拿现用),聚丙烯酰胺(4℃冰箱冷藏) (1)玻璃板验漏5min (2)按表配置分离胶

(3)灌胶,加酒精封压,凝30min(注意不要有气泡)

(4)按表配浓缩胶,倒掉酒精,用吸水纸吸去酒精,灌胶,插梳子(注意不要有气泡),凝30min (5)取胶,用水冲洗一下浓缩胶,加少量水放入一次性手套中4℃冰箱保存备用 2. 样品处理

准备:PBS,移液枪,1.5mlEP管

(1)稀释样品:一般每孔上样5ul,即1mg/ml浓度的样品,测完蛋白含量后,将样品用PBS稀释至1mg/ml(注意loadingbuffer的加入也得算入)

(2)取出上样样品15ul至1.5 ml离心管中,加入6×SDS 上样缓冲液3ul至终浓度为1×。(上样总体积一般不超过15 μl,加样孔的最大限度可加20 μl样品。) (3)将样品在100℃煮5 min震荡使蛋白完全变性(注意仪器操作) 3. 电泳

准备:电泳液500ml(现配),蛋白胶,10ul移液枪(枪头),样品,Marker,冰盒,电泳装置

(1)将SDS-PAGE胶放入电泳槽中,加足够的电泳液。(短玻璃板面向内,长玻璃板面向外。若只跑一块胶,那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。电泳液至少要漫过内测的短玻璃板。注意先检漏。) (2) 上样。用移液枪贴壁吸取样品,将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。(加样太快可使样品冲出加样孔,若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时,进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次,以免交叉污染。)

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