扁蓄提取物杀螨活性的研究- 副本 - 图文

山东农业大学硕士学位论文３．１２对谷胱甘肽．Ｓ．转移酶活性的影响，、６００∞ｇ５００ｏ吾４００＞譬３００《Ｕｇ２００∽厶Ｒ１００１｝ｇ丑０８ｈ１６ｈ２４ｈ３２ｈ４０ｈ４８ｈ时间Ｔｉｍｅ／ｈ图９篇蓄活性物质对朱砂叶螨ＧＳＴｓ酶活性的影响Ｆｉｇ．９Ｅｆｆｅｃｔ０１１ｔｈｅＧＳＴｓａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｓｏｆＰ．ａｖｉｃｕｌａｒｅａｇａｉｎｓｔＺｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ谷胱甘肽．Ｓ．转移酶是螨类体内最活跃的解毒酶系之一，它能催化有毒的亲电化合物与内源性的还原型谷胱甘肽发生共轭反应，进行解毒代谢。由图９可知，８ｈ、２４ｈ、３２ｈ、４０ｈ时抑制作用明显，对照组比活力分别是处理组的１．２９倍、１．２６倍、１．２９倍、１．３２倍；４８ｈ时，对照组是处理组的Ｏ．５２倍。从整体情况来看，谷胱甘肽．Ｓ．转移酶是受抑制的。４讨论用有机溶剂石油醚、氯仿和甲醇分别对９种试材的活性成分进行了果表明２７种中的８种提取物对朱砂叶螨表现出较高的触杀活性。在提取物ｍｇ／ｍｌ时，蔚蓄、藿香和大风子的氯仿提取物，大风子、篇蓄、３７４．１杀螨活性植物的筛选抽提，对抽提得到的２７种提取物进行了对朱砂叶螨的触杀活性测定。结浓度达到２蔓董堡壑塑墨堕堡丝堕塑壅鸡血藤、皂角刺和使君子的石油醚提取物表现出较理想的杀螨效果。随后，又对这８种有较高活性的提取物进行了朱砂叶螨的触杀毒力测定。结果表明，这８种提取物中藿香的氯仿提取物的毒力最高，其次是使君子的石油醚提取物和篇蓄的氯仿提取物。周三云等（２００８）从鸡血藤中分离到黄酮化合物和甾醇类化合物，黄文强等（２００６）从使君子中分离得到豆甾醇，这些成分可能有杀螨活性。藿香中的挥发油和黄酮（李立忠等，２００５），使君子中丰富的脂肪油和甾醇（黄文强等，２００６），以及大风子中的萜类化合物（柴兴云等，２００６）可能和这３种提取物的杀螨活性有关。有关作者筛选出的８种提取物对朱砂叶螨的杀螨活性的报道较少。４．２萧蓄提取物对朱砂叶螨的触杀作用浓度为２ｍｇ?ｍＬ。１时，石油醚、氯仿和甲醇提取物对害螨的毒力测定结果表明：氯仿提取物的触杀活性明显大于其余２种有机溶剂提取物０＜０．０５），４８ｈ死亡率达到８９．２６％，以此作进一步的萃取与纯化。将触杀效果较好的氯仿提取物用甲醇和石油醚进行萃取分离，杀螨效果为中间不溶物＞甲醇萃取物＞石油醚萃取物，因此对中间不溶物做进一步的细分离。吸附柱色谱是分离天然产物最常使用的方法之一。本试验中萃取物经过吸附柱色谱用一系列配比的流动相洗脱，得到１９个杀螨活性物质流份，流分１６死亡率、得率均最高，因此对其进一步分析，从而得出其结构，为合成新型杀螨剂提供依据。４．３对螨超微结构的观察本试验对朱砂叶螨的病变细胞，包括细胞膜及各种细胞器，如线粒体、内质网、细胞核、高尔基体等观察，发现它们有明显的变化。其细胞核的双层细胞膜分离，核仁缩小，其他结构均遭到破坏；高尔基体的扁平膜囊分解，小液泡杂乱分布；线粒体变化最明显，内脊紊乱、细胞膜溶解；内质网溶解。这些细胞和细胞器分别与物质代谢、能量的转移３８山东农业大学硕士学位论文和信号的转导有关（张宗炳，１９８２）。由此可以初步推测蔚蓄的提取物对朱砂叶螨的消化系统和神经系统有影响。为了进一步确定，本试验又测了与此相关的几种酶的活性。４．４提取物对螨体内酶活性的影响发现了此成分对朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶（ＡｃｈＥ）、Ｎａ＋，Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅ、ＧＳＨ．Ｓ．转移酶的活性，均产生了不同程度的影响。大多数杀螨剂是通过干扰神经系统来发挥致死作用的，而且其中毒特征多表现为战栗、痉挛、麻痹或是其他行为发生改变。神经细胞间的化学信息传递主要依靠神经传递素的合成与分解，已经报道了许多被公认的神经传递素，如乙酰胆碱、伽马氨基丁酸、真硝胺等，其中已有一些被证明为杀螨剂的靶标（Ｍａｒｋｅｔａ１．，１９９４）。作者所观察到的害螨施药后的症状与上述神经毒剂的症状有相似之处，因此选择神经系统中２个重要酶系，即乙酰胆碱酯酶与Ｎ矿，Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ２种酶的活性进行测定。乙酰胆碱存在于突触间隙中并可被乙酰胆碱酯酶分解，从而终止神经兴奋的传导，一旦该酶被一定程度的抑制，促使昆虫会过度兴奋后死亡（林忠莲等，２００１）。本研究结果表明，篇蓄提取物流分１６对乙酰胆碱酯酶的活性具有明显的抑制作用，１６ｈ、４０ｈ后均可见到明显的抑制效果（图７）。神经细胞的离子组成不同于周围介质，它取决于细胞膜对不同离子的渗透性，周围介质中这些离子的浓度以及在细胞膜上离子泵的的活性（林忠莲等，２００１）。Ｎａ＋，Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ广泛分布于细胞膜及内质网等膜成分之中，与Ｎ矿，Ｋ＋的传递有关，该酶受抑制时，膜对离子的通透性降低，Ｎａ－流受抑制，引起膜Ｉ为Ｎａ＋浓度升高，造成神经膜处于持续的兴奋状态，继而引发神经系统功能紊乱，最终导致昆虫死亡（张宗炳，１９８２）。试验结果表明，药剂处理后的害螨Ｎ矿，Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ活性在４０ｈ－４８ｈ时间段内变化明显，与乙酰胆碱酯酶出现的时间段相同，且与观察到的与之相应症状出现的时间段也基本相符，由此可推断，活性物质可能通过对这两种酶活性的影响，引起神经传递的阻断从而导致螨体死亡；谷胱甘肽．Ｓ．转移酶能催化生物体内的还原型谷胱甘肽（ＧＳＨ）与外源化合物的亲电子基团发生轭合，最终形成硫醚氨酸排出体外，其活性的升高可作为动物组织损伤的敏感指标（沈同等，１９９０；深３９蔓董堡墼竺墨堕塑丝塑堑窒见顺一，１９９４）。这种高效的解毒代谢体系在生物体与外界不良环境因子的适应过程中很可能发挥重要作用。从本研究结果来看，处理组酶活性受到抑制可能会影响朱砂叶螨的正常解毒代谢，从而导致有毒物质在螨体内积累，引起死亡。４．５气相检测用气相色谱．质谱（６Ｃ．ＭＳ）联用技术分析篇蓄的挥发性物质成分，通过计算机检索并与ＮＩＳＴ２．００质谱库提供的标准质谱图对照，再结合相关文献，对各分离出的组份进行定性分析，并采用峰面积归一法计算各组分的相对质量分数。对杀螨效果理想的流分１６鉴定出了４种成分。随后，我们买到了三种成分的纯品，分别对其进行生物测定，发现单一纯品的杀螨效果并不是很理想。猜测可能是几种活性成分增效作用的结果。５结论５．１杀螨活性植物的筛选用有机溶剂石油醚、氯仿和甲醇分别对９种试材的活性成分进行了抽提，对抽提得到的２７种提取物进行了对朱砂叶螨的触杀活性测定。结果表明：在提取物浓度达到２ｍｇ／ｒｒｄ时，藉蓄、藿香和大风子的氯仿提取物，大风子、篇蓄、鸡血藤、皂角刺和使君子的石油醚提取物表现出较理想的杀螨效果。随后，又对这８种有较高活性的提取物进行了朱砂叶螨的触杀毒力测定。结果表明，这８种提取物中藿香的氯仿提取物的毒力最高，其次是使君子的石油醚提取物和篇蓄的氯仿提取物。蔚蓄分别经过冷浸、液．液萃取、柱层析分离后，经ＴＣＬ检验，相同４０５．２篇蓄提取物的分离成分合并，得到流分１９个，其中流分１６的４８ｔＪ，时杀螨率达Ｎ８７．１２％，为最高，因此将其作为进一步研究的实验材料。还需进行进一步分离，以期得到活性较强物质结构，为新的杀螨剂的开发奠定基础。