生物化学实验指导 - 图文

实验一

实验课题 实验目的(含基本技能和实验方法等) 实验难点 实验方法 实验一：氨基酸的分离鉴定——纸层析法 实验类型 对象 综合型 生物技术本科 通过对氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。 理解并应用纸层析技术对氨基酸进行分析及鉴定。 实验+示教 教学步骤 一、实验讲解 1.原理 层析法又称色谱法。1903年，发现用挥发油冲洗菊粉柱时，可将叶子的色素分成许多颜色的层圈。此后，把这种利用有色物质在吸附剂上因吸附能力不同而得到分离的方法称为色谱法（Chromatography）。虽然后来将色谱法应用于无色物质分离，但是这个名字一直沿用下来。 层析法除了吸附层析以外，还有离子交换层析和分配层析。一般认为纸层析是分配层析中的一种，但也并存着吸附和离子交换作用。分配层析是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得到分离的。通常用α表示分配系数。 课时安排20分一个物质在某溶剂系统中的分配系数，在一定的温度下是一个常数。 钟 纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的OH基具有亲水性，因此能吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。有机溶剂自上而下流动，称为下行层析；自下而上流动，称为上行层析。流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使物质在两相之间不断分配而得到分离。 显然两个物质的分配系数差得越大，则越易分开。纸层析的实际操作是在滤纸的一端（通常距纸边缘2厘米），点上样品，干后，在密闭的容器内，待纸饱和了适当的溶剂蒸气后，令溶剂从有样品的一端经过毛细管的作用，流向另一端，使样品中的混合物得到分离。这种操作常称单向层析。为了得到更好的分离，还可以作双向操作或称双向层析。即在滤纸的一角上点样品，先用一种溶系统展层后，使滤纸干燥，将纸调转90°，再用另一个溶剂系统展层物质分离后，层析点在图谱上的位置，即在纸上的移动速率，用Rf表示。 每一物质的Rf值决定于该物质在两相间的分配系数（α）和两相的体积比（AS/AL）。这两种相即是水（固定相）和有机溶剂（流动相）。两相体积比在同一实验情况下是不变的，所以Rf值的主要决定因素是分配系数（α）。对于某一物质在一条件下的α值是固定的。因此Rf值为其特征常数。现将影响Rf值的因素概括如下： (1)物质结构的影响：极性物质是易溶于极性溶剂（水）中，非极性物质是易溶于非极性溶剂（有机溶剂）中，所以物质的极性大小决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况。例如酸性和碱性氨基酸极性大于中性氨基酸，所以前者在水（固定相）中分配较多，因此Rf低于后者。 —CH2—基是疏水性基团，如果分子中极性基数目不变，则—CH2—基增加，整个分子的极性就降低，因此易溶于有机溶剂（流动相）中，Rf值亦随之增加，例如氨基酸的Rf值：甘氨酸＜丙氨酸＜亮氨酸，二羧基氨基酸中，天冬氨基酸＜谷氨酸。极性基团的位置不同也会引起Rf变化，例如在正丁醇-甲酸-水系统中层析时，α-丙氨酸的Rf值大于β-丙氨酸。 （2）溶剂的影响：同一物质在不同溶剂中Rf值不同，选择溶剂系统时应使被分离物质在适当Rf值范围内（0.005到0.85之间），并且不同物质的Rf至少差别为0.05才能彼此分开。 溶剂的极性大小也影响物质的Rf值。在用与水互溶的脂肪醇作为溶剂时，氨基酸的Rf值随着溶剂碳原子数目增加而降低。 （3）pH的影响：溶剂系统的pH会影响物质极性基团的解离形式，例如氨基酸在酸性或碱性溶剂中变化如下：对于酸性氨基酸则在酸性时所带净电荷比碱性时少。带电荷越少亲水性越小，因此在酸性溶剂中Rf值较碱性中大。而碱性氨基酸则与此相反。借此性质用酸相和碱相溶剂进行双向层析，可使酸碱性不同的氨基酸达到分离的目的。溶剂的pH还可影响有机溶剂（流动相）含水量，溶剂酸碱度大，则含水量多。对于极性物质如（氨基酸）来说Rf值增加，非极性物质则减少。若pH不适合，使同种物质有不同解离形式，其Rf也略有不同，则此物质层析呈带状图谱。因此溶剂中的酸或碱的含量必须足够，并且层析缸（或箱）中用酸或碱的气体饱和才可以防止上述现象，使物质得到圆点状图谱。 （4）滤纸的影响：层析滤纸必须质地均匀、紧密，有一定机械强度，并且杂质较少，如纸中含有Ca2+、Mg2+、Cu2+等金属离子杂质，可与氨基酸形成络合物使层析图谱出现阴影，可用稀酸（0.01mol?L—1或0.4mol?L—1HCl）洗涤滤纸除去之。 （5）温度的影响：温度不仅影响物质在溶剂中的分配系数，而且影响溶剂相的组成及纤维素的水合作用。温度变化对Rf值影响很大，所以层析最好在恒温室中进行，控制温度相差不超过±0.5℃。 除上述因素影响Rf值外。样品中含有盐份和其他杂质以及点样过多均会影响样品的课时安有效分离。 排20分无色物质的层析图谱可用光谱法（紫外光照射）或显色法鉴定，氨基酸层析图谱常钟 用茚三酮或吲哚醌作显色剂。 茚三酮显色反应受温度、pH、时间影响较大，如果要使实验结果能很好重复，必须严格控制上述条件。样品中如含有大量盐酸会使氨基酸不易显色，如含有大量盐时显色点上会出现白斑，此外空气中的杂质如氨、硫化氢或酚等都会影响显色结果。铜离子可以与氨基酸-茚三酮显色物形成络合物，颜色较稳定。用硫酸酮乙醇溶液洗脱层析后的显色斑点，借比色法可定量测定氨基酸含量。 2.实验器材及试剂 （一）器材 1.层析缸2.毛细管3.喷雾器4.层析滤纸5.直尺7.铅笔8.吹风机 （二）试剂 ①扩展剂：4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。将20毫升正丁醇和5毫升冰醋酸放入分液漏斗中，与15毫升水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。取漏斗内的扩展剂约5毫升置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。 ②氨基酸溶液：0.5%的A、B、C、D、E、F氨基酸溶液（可能为赖氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸）及一种氨基酸的混合液G（含有上述氨基酸的一种或几种），各组份浓度均为0.5%。 ③显色剂：0.1%水合茚三酮丙酮溶液。 二、学生做实验 1.操作步骤 （1）将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。 （2）取层析滤纸（长18—20厘米，宽14厘米）一张。在垂直于纸的纹路一端距边缘2—3厘米处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔2厘米作一记号，作为点样位置，并用铅笔在点样点下端写出所点氨基酸的编号，剪掉层析端的两个直角。 （3）点样：用移液器（或毛细管）将各氨基酸样品分别点在所标位置上。电吹风吹干后再点一次，共点三次。每点在纸上扩散的直径最大不超过3毫米（每次上样量不要超过1uL）。 （4）扩展：把点完样品的层析滤纸放入层析缸内，扩展剂的液面需低于点样线1厘米。待溶剂上升15厘米左右时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。 （5）显色：用喷雾器均匀喷上0.1%茚三酮丙酮溶液；然后置烘箱中烘烤5分钟（100℃）或用热风吹干即可显出各层析斑点。 （6）计算：取斑点中心，测量中心点到点样点的距离和前沿线到点样线的距离，计算结果。 课时安2.结果分析与讨论 排 各种氨基酸的Rf值 70分钟 （1）请根据所上表所提供的几种氨基酸在正丁醇-乙酸溶液中的Rf值，鉴定出A、B、C、D、E和F氨基酸的名称，并在层析结果上标出； （2）利用同样的方法鉴定出混合氨基酸样品G中氨基酸的种类及名称，并同样在层析结果上标出； （3）对这几种氨基酸移动快慢的原因做出简要分析； （4）将层析图谱粘贴于实验报告并完成实验报告。 3.实验注意事项: （1）氨基酸的层析方向是顺着滤纸纹路； （2）裁剪滤纸时一定要戴手套，避免手与滤纸的直接接触防止汗液污染； （3）划线时一定要使用铅笔，禁止使用油性水笔； （4）点样时要遵循“少量多次”原则，避免点样过多导致层析条带不易分析； （5）展层液要低于点样位置1CM左右，切勿没过点样线； （6）测量时应选择多次选择中心点的位置，并取平均值。 小 对本节实验主要内容进行总结。 结 实验报交完整实验报告。 告 实验二

实验课题 实验二：酪蛋白的制备及蛋白质性质鉴定 实验类型 对象 综合型 生物技术本科 实验目的(含基1、学习从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法。 本技能2、掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。 和实验方法等) 实验难 点 实验方实验+示教 法 教学步骤 一、实验讲解 1.原理：牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。 2.双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出1个分子氨后得到的产物在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过1个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 3.考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。 考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料课时安复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光排 吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。 20分钟 蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合，在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1小时内保持稳定。蛋白质-染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质含量。