组织工程与干细胞研究所实验方法 - 图文

实验十四 小鼠iPS干细胞的诱导

1. 准备材料

慢病毒；助转剂polybrene（10mg/ml）；饲养层细胞细胞；MEF细胞；0.1% gelatin; FuGENE? HD（Roche） 2. 几点说明

2.1 本实验室采用cell biolabs公司的慢病毒载体pLentG-KOSM（ltv-700），其同时携带四个人的基因：OCT4, SOX2, C-MYC和KLF4。

2.2 由预实验可知，慢病毒感染MEF细胞的比例为10：1（即10个病毒颗粒对应一个细胞时所有的细胞均能被感染上）。

2.3 病毒感染可分悬浮感染和贴壁感染两种，两种方法均可行，不影响感染效率，细胞生长不受影响，故均可用。

2.4 开始病毒感染实验以前，请先准备好滋养层细胞（feed cells）。

3. 病毒包装（该操作以Roche公司的转染试剂FuGENE? HD为例，其它转染试剂可参照各自的使用说明书进行。）

3.1 传293T细胞。传代当天记为第一天，若第二天进行转染，铺9-10×106/T75；若第三天转染，铺3.5-4×106万/T75。每瓶T75加10mL 10％DMEM培养基。 3.2转染当天观察细胞密度，80-90％满即可进行转染。转染前无需换培养基。 3.3做脂转complex：无血清DMEM需在37度水浴中预热，Fugene转染试剂需恢复至室温方可使用，使用前需摇匀。 转染每瓶T75的complex成分如下： pLentG-KOSM：15μg pMDL：5μg VSV：3μg REV：2μg

DMEM补足至1mL后，用1mL枪混匀，正常吹打5-6次，加入100μl Fugene转染试剂，加至DMEM液面之下，吹打3-4次。再用1mL枪混匀，正常吹打5-6次，室温放置15min，即可加入T75瓶中。晃匀后，隔2-4h后再晃匀一次即可。

3.4转染后12-24h，将T75瓶中的培养基弃去，加入10％ DMEM 10mL，即开

始收集病毒。收集24-48h 病毒上清，收集后置于4度冰箱保存。 4. 病毒感染步骤（悬浮感染方案）

4.1 先用0.1% gelatin预包被一个T25瓶，包被时间约为10min。

4.2 待细胞生长良好时，用0.25% trypsin消化，收集到一个15ml离心管中，用血小板计数板计数。之后取出用于感染实验所需的细胞量（比如1×105）。 4.3 若感染1×105的细胞，以感染比例10：1计算出所需的病毒量，将所需的各个病毒量加入一个15ml离心管中，混匀后，用0.45um过滤器过滤以去除其中的细胞碎片等杂质，避免对后续实验的影响。

4.4 然后将1×105的细胞加入已经过滤好的病毒溶液中，溶液体积最后补足至5ml，最后加入5ul助转剂polybrene（使用浓度为10ug/ml），将整个体系混匀后，转移到已经预包被好的T25 瓶中, 摇匀后放入37度培养箱中，过夜。 4.5 病毒感染24小时后（第1天），将昨日感染的细胞消化下来，铺到事先准备好的饲养层细胞上。按T75瓶每瓶铺5×104的细胞，铺2个T75瓶即可。 4.6 第2天，将DMEM培养液换成ESC培养液，继续培养。以后每2天换液一次。

4.7 逐日观察，待细胞长至第4-6天时，可见小的细胞聚集，细胞形态已经明显发生了改变，由梭形变圆形，生长聚集在一起。

4.8 直至第12天，由于MEF使用时间过长，故培养液换成CM(conditioned medium)，以提供给细胞充足的营养。

4.9 待细胞长至第14天左右，可以挑克隆，将ES-like clone挑至新的饲养层细胞上，按ESC培养方法继续培养，扩增。iPS 克隆与正常的胚胎干细胞在形态上基本无异。

（刘 康）

实验十五 关节软骨细胞的原代培养

1. 取4周龄新西兰乳兔1只，耳缘静脉空气栓塞致死。

2. 酒精浸泡消毒双膝和双肘关节，剥离此处皮肤，用咬骨钳咬断髋关节及踝关节，将游离出的组织放入含双抗的 PBS 中。

3. 在超净台上分离关节软骨面,仔细清除软骨表面滑膜，刀片削下软骨，将其剪碎成1mm3大小碎片，PBS冲洗3次。

4. 置入50ml离心管中，然后加入等体积胰酶,放于37℃恒温水浴消化45min，每5分钟振荡。

5. 取出离心管，1500转/分离心5分钟，弃上清，加入等体积0.1 %Ⅱ型胶原酶后，放于37℃恒温水浴消化8h（第4h后可替换一次0.1 %Ⅱ型胶原酶）。 6. 取10% FBS的DMEM培养基入离心管稀释，离心，弃上清，再次加入10% FBS的DMEM培养基入离心管稀释，离心，弃上清，最后将沉淀移入T75细胞瓶中，加20% FBS的DMEM培养基10ml于瓶内，静置于5 % CO2，37℃培养箱培养，3天后换液。

（赵 明）

实验十六 脂肪干细胞的原代培养

1. 取新西兰兔一只，耳缘静脉空气栓塞致死。

2. 用酒精搽拭取腹股沟处（或背部），无菌条件下取腹股沟处（或背部）脂肪。 3. 酒精泡30秒，PBS洗两次，置入无菌培养皿中。

4. 在无菌操作台剪去血管等异物组织，尽量清除干净（血管内皮细胞会竞争生长），充分剪碎脂肪（需要不断剪切组织约1小时以上），转移至50ml离心管。 5. 加入等体积0.1%II胶原酶于离心管中，置于37℃水浴锅 45min (每5分钟摇晃一次)。

6. 2000r/min离心10min，轻倒上层组织，将剩余沉淀倒入T25方瓶，加3-4ml 10% FBS的DMEM培养基于T25方瓶中，两天后换液。

（赵 明）

实验十七 人髓核细胞的培养

1. 无菌条件下行椎间盘摘除术，离体的组织用PBS液清洗2-3遍，以去除血液。再将组织放入预先准备好的无菌培养瓶中（含20％FBS的DMEM培养液数毫升和足量的青霉素100 U/ml、链霉素100 U/ml）。将培养瓶置入冰盒，30min内送至实验室；

2. 取出椎间盘组织置于培养皿中，用PBS液冲洗数次，直至组织中的血迹除尽； 3. 用眼科剪、眼科镊小心地将外层纤维环(OAF)、内层纤维环(IAF)、髓核（NP）仔细分离，去除终板及肌肉组织；

4. 将髓核标本分别放入到新的培养皿中，用PBS液冲洗3遍。用眼科剪将髓核组织剪碎至1mm3大小，将组织混合液转入15ml的离心管中； 5. 1,500rpm离心5min，尽量除去上清液；

6. 加入20倍组织体积的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，在37oC的条件下消化髓核组织 20min，每5min摇动离心管1次； 7. 1,500rpm离心5min，去除上清液；

8. 向消化的组织中加入适量0.2%的Ⅱ型胶原酶（sigma），37oC恒温水浴消化2h，每5-10min摇动离心管1次； 9. 1,500rpm离心5min，去除上清液； 10. 重复第8-9步骤操作1次；

11. 用适量20％FBS的DMEM培养液漂洗，以1,500rpm离心5min，去除上清液，

12. 重复上述步骤 3次，直至胶原酶完全清洗干净；

13. 用20％FBS的DMEM培养液1ml轻轻吹散细胞，计数板进行细胞计数，按2×105/ml接种于75 cm2培养瓶中，用20％FBS的DMEM培养液10ml重悬，加入足量的青霉素100 U/ml、链霉素100 U/ml，将培养瓶置于含95%空气、5%CO2的37oC细胞培养箱中培养；

14. 每2-3d换培养液1次，每2d用倒置显微镜观察细胞贴壁及生长情况，并拍照。

（罗栩伟）