实验九 酵母蔗糖酶（最后）

先将层析柱垂直装好，在烧杯内用0.02 mol/L pH 7.3 Tris-HCl 缓冲液洗纤维素几次，用滴管吸取烧杯底部大颗粒的纤维素装柱，然后用此缓冲液洗柱至流出液的电导率与缓冲液相同或接近时即可上样。

3. 上样与洗脱：

上样前先准备好梯度洗脱液，本实验采用20ml 0.02M pH7.3的Tris-HCl缓冲液和20ml含0.2M浓度NaCl的0.02mol/L pH7.3的Tris-HCl缓冲液，进行线性梯度洗脱。取两个相同直径的50ml小烧杯，一个装20ml含NaCl的高离子强度溶液，另一个装入20ml低离子强度溶液，放在磁力搅拌器上，在低离子强度溶液的烧杯内放入一个小搅拌子（在细塑料管内放入一小段铁丝，两端用酒精灯加热封口），将此烧杯置于搅拌器旋转磁铁的上方。将玻璃三通插入两个烧杯中，上端接一段乳胶管，夹上止水夹，用吸耳球小心地将溶液吸入三通（轻轻松一下止水夹），立即夹紧乳胶管，使两烧杯溶液形成连通，注意两个烧杯要放妥善，切勿使一杯高、一杯低。

用5ml 0.02mol/L pH7.3的Tris-HCl缓冲液充分溶解醇级分Ⅲ，（注意玻璃搅棒头必须烧园、搅拌溶解时不可将离心管划伤），若溶液混浊，则用小试管，4000rpm离心除去不溶物。取1.5ml上清液（即醇级分Ⅲ样品，留待下一个实验测酶活力及蛋白含量），将剩余的3.5ml清液小心地加到层析柱上，不要扰动柱床，注意要从上样开始使用部分收集器收集，每管2.5~3.0ml/10min。上样后用缓冲液洗两次，然后再用约20ml缓冲液洗去柱中未吸附的蛋白质，至A280降到0.1以下，夹住层析柱出口，将恒流泵入口的细塑料导管放入不含NaCl的低离子强度溶液的小烧杯中，用胶布固定塑料管，接好层析柱，打开磁力搅拌器，放开层析柱出口，开始梯度洗脱，连续收集洗脱液，两个小烧杯中的洗脱液用尽后，为洗脱充分，也可将所配制的剩余30ml高离子强度洗脱液倒入小烧杯继续洗脱，控制流速2.5~3.0ml/10min。

测定每管洗脱液的A280光吸收值和电导率。（使用DJS-10电导电极）

测定不含NaCl的0.02mol/L pH7.3 Tris-HCl缓冲液和含0.2mol/L浓度NaCl的0.02mol/L pH7.3 Tris-HCl缓冲液的电导率，用电导率与NaCl浓度作图，利用此图将每管所测电导率换算成NaCl浓度，并利用此曲线估计出蔗糖酶活性峰洗出时的NaCl浓度。 4. 各管洗脱液酶活力的定性测定

在点滴板上每一孔内，加一滴0.2mol/L pH4.9的乙酸缓冲液，一滴0.5mol/L蔗糖和一滴洗脱液，反应5分钟，在每一孔内同时插入一小条尿糖试纸，10～20min后观察试纸颜色的变化。用“+”号的数目，表示颜色的深浅，即各管酶活力的大小。合并活性最高的2~3管，量出总体积，并将其分成10份，分别倒入10个小试管，用保鲜膜封口，冰冻保存，使用时取出一管。此即“柱级分IV”。

注意：从上样开始收集，可能有两个活性峰，梯度洗脱开始前的第一个峰是未吸附物，本实验取用梯度洗脱开始后洗下来的活性峰。 在同一张图上画出所有管的酶活力，NaCl浓度（可用电导率代替）和光吸收值A280的曲线和洗脱梯度线。

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（三）蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定

一、实验目的

掌握蔗糖酶活性测定方法，了解各级分酶的纯化情况。

二、原理

为了评价酶的纯化步骤和方法，必须测定各级分酶活性和比活。

测定蔗糖酶活性的方法有许多种，如费林试剂法、Nelson’s试剂法、水杨酸试剂法等，本实验先使用费林试剂法，以后测米氏常数Km和最大反应速度Vmax时再用Nelson’s试剂法。

费林试剂法灵敏度较高，但数据波动较大，因为反应后溶液的颜色随时间会有变化，因此加样和测定光吸收值时最好能计时。其原理是在酸性条件下，蔗糖酶催化蔗糖水解，生成一分子葡萄糖和一分子果糖。这些具有还原性的糖与碱性铜试剂混合加热后被氧化，二价铜被还原成棕红色氧化亚铜沉淀，氧化亚铜与磷钼酸作用，生成兰色溶液，其兰色深度与还原糖的量成正比，于650nm测定光吸收值。

三、试剂

1. 碱性铜试剂（用毕回收）

称10g无水NaCO3 ,加入100ml去离子水溶解，另称1.88g酒石酸，用100ml去离子水溶解，混合二溶液，再加入1.13克结晶CuSO4，溶解后定容到250ml。

2. 磷钼酸试剂（用毕回收）

在烧杯内加入钼酸17.5g，钨酸钠2.5g，10% NaOH 100ml, 去离子水100ml，混合后煮沸约30min（小心不要蒸干），驱去钼酸中存在的氨，直到无氨味为止，冷却后加85%磷酸63ml,混合并稀释到250ml。

3. 0.25%苯甲酸200ml，配葡萄糖用，防止时间长溶液长菌，也可以用去离子水代替。 4. 葡萄糖标准溶液：

（1）贮液：精确称取无水葡萄糖（应在105℃恒重过）0.1802克，以0.25%苯甲酸溶液溶解后，定容到100ml容量瓶中（浓度10mmol/L）。

（2）操作溶液：用移液管取贮液10ml，置于50ml容量瓶中，以用0.25%苯甲酸或去离子水稀释至刻度（浓度为2mmol/L）。

5. 0.2mol/L蔗糖溶液50ml，分装于小试管中冰冻保存，因蔗糖极易水解，用时取出一管化冻后摇匀。

6. 0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.9，200ml。

7. 牛血清清蛋白标准蛋白质溶液（浓度范围：200～500?g/ml，精确配制50ml）。 8. 考马斯亮兰G-250染料试剂，100mg考马斯亮兰G-250全溶于50ml 95%乙醇后，加入120ml 85%磷酸，用去离子水稀释到1L（公用）。

四、仪器

1. 试管20支，试管架1个 2. 秒表1块，或用手表。 3. 移液管：0.1、0.2、2.0、5.0ml

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4. 塑料可见比色杯（杯上和器皿染色后可用少量95% 的乙醇荡洗） 5. 水浴锅 6. 电炉 7. 保鲜膜 8. 橡皮筋

五、各级分蛋白质含量的测定

采用考马斯亮兰染料法（Bradford法）的微量法测定蛋白质含量，参见 实验－“蛋白质含量的测定法”（因Tris会干扰Lowry法的测定）。标准蛋白的取样量为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0ml，用去离子水补足到1.0ml。

各级分先要仔细寻找和试测出合适的稀释倍数，并详细记录稀释倍数的计算（使用移液管和量筒稀释）。下列稀释倍数仅供参考： 粗级分 I： 10～50倍 热级分II： 10～50倍

醇级分III： 10～50倍 柱级分IV： 不稀释

确定了稀释倍数后，每个级分取3个不同体积的样进行测定，然后取平均值，计算出各级分蛋白质浓度。

六、级分I、II、III蔗糖酶活性测定

用0.02mol/L pH4.9乙酸缓冲液（也可以用pH5～6的去离子水代替）稀释各级分酶液，试测出测酶活合适的稀释倍数： I ： 1000～10000倍 II ： 1000～10000倍 III ： 1000～10000倍 以上稀释倍数仅供参考。

按“表1”的顺序在试管中加入各试剂，进行测定，为简化操作可取消保鲜膜封口，沸水浴加热改为用90～95℃水浴加热8～10min。

七、柱级分IV酶活力的测定

1. 酶活力的测定参照“表1”设计一个表格，反应混合物仍为1ml。

2. 第1管仍为蔗糖对照，9、10管为葡萄糖的空白与标准，与“表1”中的11、12管相同。

3. 2～7管加入柱级分IV（取样前先试测出合适的稀释倍数），分别为0.02 ml、0.05 ml、0.1 ml、0.2 ml、0.4 ml和0.6ml，然后各加0.2ml乙酸缓冲液（0.2mol/L pH4.9），每管用去离子水补充到0.8ml。

4. 1~7管各加入0.2 ml 0.2mol/L的蔗糖，每管由加入蔗糖开始计时，室温下准确反应10min，立即加入1ml碱性铜试剂中止反应，然后按“表1”中的步骤进行测定。

5. 第8管为0时间对照，与第7管相同，只是在加入0.2ml蔗糖之前，先加入碱性铜试剂，防止酶解作用。此管只用于观察，不进行计算。 6. 计算柱级分IV的酶活力： Units / ml原始溶液。

7. 以每分钟生成的还原糖的?moles数为纵座标，以试管中1ml反应混合物中的酶浓

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度（mg蛋白/ml）为横座标，画出反应速度与酶浓度的关系曲线。

表 1 级分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的酶活力测定 各管名称→ 对照 粗级分Ⅰ 热级分Ⅱ 醇级分Ⅲ 葡萄糖 管数→ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 0.0 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 / / 酶液(ml) H2O(ml) 0.6 0.55 0.40 0.10 0.05 0.20 0.10 0.55 0.40 0.10 1.0 0.8 乙酸缓冲液 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / / (0.2mol/L pH4.9) / / / / / / / / / / / 0.2 葡萄糖2mmol/L 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / / 蔗糖0.2mol/L 加入蔗糖，立即摇匀开始计时，室温准确反应10min后，立即加碱性铜试剂中止反应。 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 碱性铜试剂 用保鲜膜封口，扎眼，沸水浴加热8min，立即用自来水冷却。 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 磷钼酸试剂 H2O 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 A650nm E’=μmol/min·ml 平均E’ μmol/min·ml Units/ml原始组分

稀释后酶液的活力(按还原糖计算)：

E'?A650?0.2?2μmoles（）A'650?10?Bmin?ml 式中： A650 ──第2~10管所测A650 A’650──第12管所测A650

0.2 ── 第12管葡萄糖取样量

2 ── 标准葡萄糖浓度2mmol/L = 2μmol/ml

10 ──反应10min B ──每管加入酶液ml数

原始酶液的酶活力 E = (平均E’/2)×稀释倍数（Units / ml原始组分）

八、计算各级分的比活力，纯化倍数及回收率，并将数据列于下表：

为了测定和计算下面纯化表中的各项数据，对各个级分都必须取样，每取一次样，对于下一级分来说会损失一部分量，因而要对下一个级分的体积进行校正，以使回收率的计算不致受到不利的影响。

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