2015年版微生物限度检验操作规程

3.1需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的总菌落数（包括真菌菌落数）；霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的总菌落数（包括细菌菌落数）。若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌和酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉素、庆大霉素）的沙氏葡萄糖琼脂培养基或其他选择性培养基（如玫瑰红钠培养基）进行霉菌和酵母菌总数测定。使用选择性培养基时应进行培养基适用性检查。

3.2各品种项下规定的微生物限度标准解释如下：

101cfu：可接受的最大菌数为20； 102cfu：可接受的最大菌数为200；

103cfu：可接受的最大菌数为2000，以此类推。

3.3若供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的检查结果均符合该品种项下的 规定，判供试品符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下的规定，判供试品不符合规定。

控制菌检查法

l、简述

控制菌检查法是用于在规定的试验条件下，检查供试品中是否存在某些特定微生物。本标准的控制菌为大肠埃希菌[CMCC(B) 44102]、铜绿假单胞菌 [CMCC(B) 10104]和金黄色葡萄球菌 [CMCC(B) 26003]

供试品检出控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。 供试液制备及实验环境要求同“微生物计数法”。

2、培养基适用性检查和控制菌检查方法 适用性试验

供试品控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性检查。供试品的控制菌检查方法应进行适用性验证。

2.1菌种 试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0袋），并采用适宜的菌种保藏技术进行保藏。

金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus [CMCC(B) 26003] 铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa [CMCC(B) 10104] 大肠埃希菌Escherichia coli [CMCC(B) 44102]

乙型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi B）[CMCC(B) 50094] 白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F) 98001] 生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC(B) 64941] 2.2菌液制备

将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙门菌分别接种于胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基上， 30～35℃培养18～24h；

将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基或沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃

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培养2～3天；

将生孢梭菌接种于梭菌增菌培养基中置厌氧条件下30～35℃培养24～48h，或接种于硫乙醇酸盐流体培养基中30～35℃培养18～24h。

上述培养物用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液。

菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2-8℃，可在24小时内使用。生孢梭菌孢子悬液可替代新鲜的菌悬液，孢子悬液保存在2-8℃，在验证过的贮存期内使用。

2.3阴性对照 为确认试验条件是否符合要求，应进行对照试验，阴性对照试验应无菌生长。

2.4培养基适用性检查 控制菌检查用的培养基应进行培养基适用性检查。检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示特性的检查。各培养基的检查项目及所用菌株见下表2。

表2 控制菌检查用培养基的促生长能力、抑制能力及指示特性

控制菌检查 耐胆盐革兰阴性菌 培养基 肠道菌增菌液体培养基 特性 促生长能力 抑制能力 试验菌株 大肠埃希菌、铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌、铜绿假单胞菌 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 乙型副伤寒沙门菌 金黄色葡萄球菌 乙型副伤寒沙门菌 乙型副伤寒沙门菌 铜绿假单胞菌 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 生孢梭菌 生孢梭菌 白色念珠菌 白色念珠菌 白色念珠菌 大肠埃希菌 紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基 大肠埃希菌 麦康凯液体培养基 麦康凯琼脂培养基 沙门菌 RV沙门菌增菌液体培养基 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基 三糖铁琼脂培养基 溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基 甘露醇氯化钠琼脂培养基 梭菌增菌培养基 哥伦比亚琼脂培养基 沙氏葡萄糖液体培养基 沙氏葡萄糖琼脂培养基 念珠菌显色培养基 促生长能力+指示特性 促生长能力 抑制能力 促生长能力+指示特性 促生长能力 抑制能力 促生长能力+指示特性 指示能力 促生长能力 抑制能力 促生长能力+指示特性 抑制能力 促生长能力 促生长能力 促生长能力 促生长能力+指示特性 促生长能力+指示能力 抑制能力 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌 梭菌 白色念珠菌

2.4.1液体培养基促生长能力检查 分别接种不大于100cfu的表2的试验菌株与被

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检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及不大于规定的最短培养时间下培养，与对照培养基比较，被检培养基试验菌应生长良好。

2.4.2固体培养基促生长能力检查 用涂布法分别接种不大于100cfu的表2的试验菌株与被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及不大于规定的最短培养时间下培养，被检培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态应一致。

2.4.3培养基抑制能力检查 接种不少于100cfu的表2的试验菌株与被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及不大于规定的最短培养时间下培养，试验菌应不得生长。

2.4.4培养基指示特性的检查 用涂布法分别接种不大于100cfu的表2的试验菌株与被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及不大于规定的最短培养时间下培养，被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂能力等英语对照培养基一致。

2.5控制菌检查方法适用性检查

2.5.1供试液制备：按“供试品检查”中规定的方法制备供试液。

2.5.2试验菌 根据各品种项下微生物限度标准中规定的检查控制菌选择相应的试验菌株。确认耐胆盐革兰阴性菌检查方法是，采用大肠埃希菌和铜绿假单胞菌为试验菌。

2.5.3适用性检查 按控制菌检查法取规定量供试液及不大于100cfu的试验菌接入规定的培养基中，采用薄膜过滤法是取规定量供试液，过滤冲洗，在最后一次冲洗液中加入试验菌，过滤后注入规定的培养基或取出滤膜接入规定的培养基中。依相应控制菌检查方法，在规定的温度和最短培养时间下培养，应能检出所加试验菌相应的反应特征。

2.5.4结果判断 上述试验若检出试验菌，按此供试液之被罚和控制菌检查方法进行供试品检查；若未检出试验菌，营销处供试品中的抑菌活性（中国药典2015年版四部通则1105中抗菌活性的去除或灭活），并重新进行方法适用性试验。

若经过试验确证供试品对试验菌的抗菌作用无法消除，可认为受抑制的微生物不易存在于该供试品中，选择抑菌成分消除相对彻底的方法进行供试品的检查。

3、供试品检查 供试品的控制菌检查应经方法适用性试验确认的方法进行。 3.1阳性对照 阳性对照试验方法同供试品的控制菌检查，对照菌的加入量应不大于100cfu，阳性对照应检出相应的控制菌。

3.2阴性对照 以稀释剂代替供试液照相应控制菌检查法检查，阴性对照应无菌生长。

3.3大肠埃希菌（Escherichia coli）

3.3.1供试液制备和增菌培养 取供试品，照“微生物计数法”制成1:10的供试液，取相当于1g或1ml供试品的供试液，接种于适宜体积（经方法适用性试验确定）的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24h。

3.3.2选择和分离培养 取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中，

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42～44℃培养24～48h。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72h。

3.3.3结果判断 若麦康凯琼脂培养基平板上有菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为大肠埃希菌；若麦康凯琼脂培养基平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出大肠埃希菌。

3.4铜绿假单胞菌 （Pseudomonas aeruginosa）

3.4.1供试液制备和增菌培养 取供试品，照“微生物计数法”制成1:10的供试液，取相当于1g或1ml供试品的供试液，接种于适宜体积（经方法适用性试验确定）的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24h。

3.4.2选择和分离培养 取上述培养物1ml接种至溴化十六烷基三甲胺琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72h。取上述平板上生长的菌落进行氧化酶试验，或采用其他适宜方法进一步鉴定。

3.4.3氧化酶试验 将洁净的滤纸片置于平皿内，用无菌玻璃棒取上述平板上生长的菌落涂于滤纸片上，滴加新配制的1%盐酸N,N-二甲基对苯二胺试液，在30秒内培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性。

3.4.4结果判断 若溴化十六烷基三甲胺琼脂培养基平板上有菌落生长，且氧化酶试验阳性，应进一步进行适宜的鉴定试验，确证是否为铜绿假单胞菌。若平板上没有菌落生长，或虽有菌落生长但鉴定结果为阴性，或氧化酶试验阴性，判供试品未检出铜绿假单胞菌。

3.5金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）

3.5.1供试液制备和增菌培养 取供试品，照“微生物计数法”制成1:10的供试液，取相当于1g或1ml供试品的供试液，接种于适宜体积（经方法适用性试验确定）的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24h。

3.5.2选择和分离培养 取上述培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72h。

3.5.3结果判断 若甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上有黄色菌落或外周有黄色环的白色菌落生长，应进行分离、纯化及适宜的鉴定试验，确证是否为金黄色葡萄球菌；若平板上没有与上述形态特征相符或疑似的菌落生长，或虽有相符或疑似菌落生长但鉴定结果为阴性，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。

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