7300 System SDS software荧光定量PCR使用指南

7300 system SDS software 荧光定量PCR仪使用指南

1. 开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启荧光定量PCR仪主机，等主机面板上的

绿灯亮后即可打开荧光定量PCR的收集软件，进行实验。

2. 打开软件7300 System SDS Software；Creat new document；Assay：选择ddCt（relative

quantitation）Plate；下一步：选中并添加一个；下一步：选中方格，上方打钩；完成。 3. Setup：右击方格，进行命名。

4. Instrument：程度设定，看染料进行设置程序。Eg：选中并删除50℃，2min的步骤，更

改其他温度条件及时间，第二个循环一般是40个；添加溶解曲线；样品体积设置； 5. 保存程序。

6. Start。开始荧光定量PCR。

7. 关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭信号收集软件，然后关掉荧光定量PCR仪主

机的电源，最后关闭电脑 查看结果：

1. 打开软件7300 System SDS Software，打开所需要查看的文件，点击results 2. 点击绿色的 运行。可以点击并查看各个样品的溶解曲线和扩增曲线。

平行3个样品扩增曲线要是能重叠说明实验数据有效性比较高。

溶解曲线是单一峰说明PCR引物设计的比较好，如果不是，则需要重新设计引物。

数据分析：

1． 打开软件7300 System SDS Software；Creat new document；Assay：选择ddCt（relative

quantitation）study，add plates：从文件夹中选中所要分析的文件。完成。 2． 导出数据。File-Export-results-both-保存。即可以查看Ct值并进行分析。 3． CT<0.5结果较好。

目标基因 （Target gene） 参照基因

（Reference gene）

试验样本 Test CT(target, test) CT(ref, test)

标准样本 Calibrator (cal) CT(target, cal) CT(ref, cal)

确定CT 值之后，可以用Livak 法，即2–ΔΔCT 法来确定实验样本相对于校准样本目标基因的相对表达水平，该方法的条件是目标基因和参照基因扩增效率都接近100% 且相互间效率偏差在5% 以内。如何确定不同样本中目标基因表达水平的相对差异， 步骤如下：

首先，对所有的测试样和校准样本，用内参基因的CT 值归一目标基因的CT 值： ΔCT(test) = CT(target, test) – CT(ref, test)

ΔCT(calibrator) = CT(target, calibrator) – CT(ref, calibrator) 其次，用校准样本的ΔCT 值归一试验样本的ΔCT 值：ΔΔCT = ΔCT(test) – ΔCT(calibrator)最后，计算表达水平比率：2–ΔΔCT = 表达量的比值