鸡肝中过氧化氢酶提取，和大肠杆菌质粒提取

大肠杆菌中质粒的小量提取及核酸电泳

摘要：采用碱裂解法将大肠杆菌中的质粒DNA分子进行分离和纯化，将分离纯化后的质粒DNA分子进行琼脂糖凝胶电泳，并在紫外成像仪中观察DNA条带，以测定所得到的质粒DNA片段的分子量大小。结果表明，成功从大肠杆菌中提取出质粒DNA分子，其分子量大小约为2000bp。

关键词：质粒DNA分子；碱裂解法；分子量；电泳

引言

质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在碱性电泳缓冲液中带负电荷，所以在外加电场作用下会向正极迁移。将提取到的DNA分子提取液中加入核酸染色剂，经过琼脂糖凝胶电泳后，利用紫外灯照射即可观察到所提取的DNA条带，第一泳道加入合适的Marker与之进行比对，即可较为准确地估测出所提取出的质粒DNA分子量。

1 材料与方法 1.1 实验材料

(1) 含质粒Psd-T19的大肠杆菌

(2) 试剂：细菌质粒小量提取试剂盒、琼脂糖，电泳缓冲液（TAE），核酸电泳上样缓冲液（6×），标准分子量的DNA等。

1.2 实验仪器

微量移液器、试管、微波炉、离心机、电泳仪、凝胶成像系统、天平。

1.3 质粒的提取（小量试剂盒提取）

(1) 首先取1.5ml混匀的菌液于1.5ml离心管中，台式离心机中12000r/m离心1min，弃上清液得到大肠杆菌菌体； (2) 按照试剂盒提取的步骤提取出大肠杆菌质粒DNA。

1.4 核酸电泳

(1) 制备1%琼脂糖凝胶，并添加GoldVied I核酸染料；

(2) 加样：在离心管中混合DNA样品2-3ul和1ul上样缓冲液。采用梯度上样，上样量分别为2ul、4ul、6ul、8ul和5ulDNA分子量标记； (3) 电泳：120V，40min；

(4) 观察：将电泳后的凝胶放置于透射紫外光下进行观察，对照分子量标记判断DNA样品的分子量大小。

2 实验结果与分析

大肠杆菌在37℃恒温摇床中220r/min培养24h，离心收集菌液收集菌液，之后按照试剂盒的操作步骤进行质粒提取纯化，最后进行核酸电泳，电泳图如图1-1所示。其中1,2,3,4分别代表质粒的上样量分别为2μL，4μL，6μL，,8μL，M代表5μL标准品。

DNA分子的分子量、分子构型的差异和所带电荷多少，都会影响电场中其迁移速率，另外琼脂糖凝胶的浓度、电压大小、缓冲液pH和电泳时的温度等也影响迁移率，从而使DNA分子在凝胶中出现不同的区带。如图1-1所示，从大肠杆菌中提取的质粒DNA分子的分子量大小为2000bp，梯度上样的对比结果表明最适上样量为6ul。

图1-1 1％核酸电泳图

3结论

所提取的质粒DNA分子量为2000kb，琼脂糖凝胶电泳最适上样量为6ul。

参考文献

[1] 叶枫,董兴齐,彭何碧.四种提取细菌质粒DNA方法的比较[J].地方病通报,1994,9(4):66.

[2] 黄永莲.琼脂糖凝胶电泳实验技术研究[J].湛江师范学院学报，30(6):83-85.

2009，

鸡肝中过氧化氢酶的提取、分离及检测

摘要：为得到鸡肝中的过氧化氢酶，首先从肝中提取可溶性的蛋白质，并测定其蛋白质的含量和过氧化氢酶的活力；然后采用硫酸铵分级盐析及透析，并测定过氧化氢酶活力；最后采用SDS-凝胶电泳鉴定过氧化氢酶的纯度和测定其分子量。选用考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量，利用分光光度计测定过氧化氢酶活力。结果表明，纯化后过氧化氢酶的总活性是4774U，比活性是155.43 U/(mg.N)，回收率是34%，纯化倍数是4.88，考马斯亮蓝G-250染色法测定的蛋白质含量是15.41 mg/ml，SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示蛋白质的相对分子质量是。

关键词：蛋白质含量；酶活力；盐析及透析

引言

过氧化氢酶（Catalase， CAT）是一种酶类清除剂，又称为触酶，是以铁卟啉为辅基的结合酶[1]。其普遍存在于能呼吸的生物体内，主要存在于植物的叶绿体、线粒体、内质网、动物的肝和红细胞中，其酶促活性为机体提供了抗氧化防御机理[2]，其次过氧化氢酶的应用也十分广泛[3]。CAT在不同的组织中其活性水平高低不同。过氧化氢在肝脏中分解速度比在脑或心脏等器官快，就是因为肝中的CAT含量水平高[4]。

考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。以牛血清白蛋白(BSA)为标准品配制浓度梯度标准液，用考马斯亮蓝G-250法进行吸光值的测定，作标准曲线，依据标准曲