综述

绿色荧光蛋白的应用及其研究进展

摘要：绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是众多报告基因中发展起步较晚，但是应用相对较为广泛的其中之一。报告基因是用于编码一些易检测蛋白质或酶的基因，通过它的表达产物来标定目的基因的表达调控。该技术具有较高的灵敏度、较方便的检测方法等特点，报告基因技术在转基因、启动子分析以及药物筛选等领域有了广泛的应用。近年来,随着荧光分析方法和技术的进步，绿色荧光蛋白成为众多报告基因中的后起之秀，本文以这绿色荧光蛋白为分析重点，综述了该报告基因的特点、应用、近年来的进展以及未来发展方向。

关键词：绿色荧光蛋白；报告基因；GFP

报告基因是一种编码某种易于检测蛋白质或酶的基因,通过它的表达产物来标定目的基因的表达调控。该技术的主要优点是高灵敏度、可信性及检测方便且适合大规模检测。目前已广泛应用于启动子分析、监控转基因及其表达、细胞的信号转导与药物的筛选等多种细胞事件。随着技术和检测方法的进步，荧光分析以其能够将细胞内报告基因的活性可视化和对细胞的非破坏性而越来越成为主流，因此绿色荧光蛋白这种可发出荧光的报告基因成为众多报告基因中的后起之秀，本文以绿色荧光蛋白为重点，综述了该报告基因的选择及其研究趋向。

一、绿色荧光蛋白基因

荧光蛋白家族是从水螅虫纲和珊瑚类动物中发现的相对分子质量为20~30kD的同源性蛋白，包括绿色、红色、色和青色荧光蛋白等。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是其中应用的最多的一种。

早在1992年，Prasher和Chalfie报道了由于能量转移至GFP才使生物发光水母的发光，即该基因最初是从维多利亚发光水母（Aequorea victoria）中分离得到。该蛋白可以接受由Ca2+激活的光蛋白水母素的能量，此后在体内产生荧光，这一过程不需要任何底物或辅助因子的参与。下村修在研究水母的发光机制时发现腔肠素（coalenterazine）和钙离子与水母发光蛋白结合后，水母发光蛋白发蓝色荧光，同时激发 GFP，使其发绿色荧光[1]，马丁·沙尔菲进一步研究了绿色荧光蛋白的发光机理，钱永健对绿色荧光蛋白的改造则使绿色荧光蛋白得到了更广泛的应用，由于对 GFP 研究及应用的突出贡献，上述 3位学者共同获得了2008 年的诺贝尔化学奖。

GFP是一条由238个氨基酸组成的多肤链。纯化的GFP与体内表达的该蛋白有相似的发光谱，无论是在原核或真核细胞中表达，当用蓝光或紫外光激发时，都能产生一种很亮的绿色荧光。除此之外，GFP还具有的低毒性、不干扰正常的细胞活动等优点。因此，开辟了GFP在生物领域中(尤其是体内分析)的广泛应用,目前已应用于启动子分析、转基因领域、基因表达的蛋白质定位、细胞定位以及药物的筛选等诸多方面[2]。

二、GFP的修饰

GFP相对分子质量小、荧光稳定、对活细胞无害、检测方法容易（通过荧光显微镜或者荧光激活细胞分选仪 FACS），还可以用流式细胞仪对悬浮细胞进行高灵敏度和特异性检测，加热、变性剂、去垢剂及一般的蛋白酶等作用均不能使它灭活。GFP的上述诸多优点已使其成为众多报告基因中的后起之秀，被称为“活细胞的分子探针”。 然而，GFP在某些特定的细胞中不表达，因此在实验前需要进行目的细胞和检测手段的初选以及GFP的修饰[3]。

目前所有的研究结果表明，GFP 对目的基因的功能无影响，大量表达对细胞也无毒性，细胞仍能连续传代培养，GFP 无论是作为瞬时表达还是长久表达的标记物都是安全的。而且通过 GFP 的荧光强弱反映表达产物的表达量，易检测，灵敏度高。

现在已经利用各种基因突变策略对GFP进行了不同的修饰与改造。这些突变旨在提高荧光强度及热稳定性，具体措施包括调整生色基团的折叠与构像、利用某些密码子、去除某些内含子等，目前已取得一些进展[4]。例如,S65T突变型比野生型明亮度高、抗光漂性强。Hiem等使GFP突变，由绿色荧光变为蓝色荧光(包括6T6H和1T45F氨基酸改变)、黄色荧光和红色荧光，光谱的变化可以同时检测多种报告基因的表达、定位、蛋白的转运以及蛋白质一蛋白质之间的相互作用。近来有报道采用GFP和蓝色荧光蛋白(BFP)的融合蛋白，荧光共振能量转换仪(FRET)检测到了细胞内垂体特异转录因子Pit-1的二聚体形成[5]。

三、GFP的表达与载体

GFP的表达与其所选的载体密切相关[6]。Zolotukihn等将单拷贝的GFPS65T突变型构建到腺病毒载体上再转染到人293细胞中，结果流式细胞仪(FACS)所检测到的荧光强度是野生型的45倍；Bierhuizen等人将各种类型的GFP构建到逆转录病毒载体上并在造血细胞中表达，结果其转染效率在90%以上，且提高了表型稳定性，Muldoon等用鼠的复制缺陷型逆转录病毒载体转染，得到了100%的阳性率。Wilson等运用新型的GFP杆状病毒表达载体，将目的基因与GFP的开放阅读框架构建在一起表达融合蛋白，当暴露于紫外光下时可以方便地检出[7]；

酵母-增强型绿色荧光蛋白(y-EGFP3)转染的酵母也可以用FACS进行定量,其荧光强度比野生型高75倍，而且可以在单细胞水平下进行检测[8]。Wang等用EGFP为报告基因，构建了六种P16INK4a启动子系列缺失的重组自我失活型逆转录病毒载体，通过比较EGFP的表达水平，然后找到了该启动子上主要转录调控元件[9]。

与传统的定位方法相比，GFP 荧光反应不需要外加底物和任何辅助因子，也就不存在这些物质难于进入细胞的问题。这种非破坏性的检测方法对实验本身极为有利。李铁等[10]在哺乳动物细胞中表达了 PS1/GFP 融合蛋白，以 GFP 绿色荧光作为 PS1 亚细胞定位的信号，初步获得PS1全长蛋白质在细胞中定位的部分信息。鲁文果等[11]用 GFP 标记小鼠胚胎干细胞(mESCs)，研究它在脑出血大鼠脑内的存活与分化，初步得出小鼠胚胎干细胞有向神经细胞分化能力的结论。

卫星细胞在成体内主要参与成熟骨骼肌的修复。Day等[12]用nestin增强子和GFP构建了nestin-GFP报告基因，发现 GFP 表达受小鼠卫星细胞 nestin 基因调节，而且随着卫星细胞的激活，nestin-GFP 表达量降低，因而能用nestin-GFP的表达来报告静止的骨骼肌卫星细胞的静止状态。为了研究星状毛囊滤胞增殖过度细胞(folliculo-stellate cells, FScells)的功能和来源，Itakura等[13]制成了表达在S-100β蛋白基因启动子控制下 GFP 的转基因鼠，因而能在活体内检测 FS 细胞，成为研究 FS 细胞的优良模型。

利用 GFP 作为报告分子，很容易从众多化合物中筛选与信号分子功能相似的化合物，使药物筛选过程简单方便、可信度高。Nagy等[14]介绍了 Ah（ary hydrocarbon）受体激动剂的成像。Ah受体是一个配基依赖的转录E-GFP因子，介导多环和芳香卤化类的有机化合物如二恶英的生物学作用和毒性作用。用一个包含完整 Ah 受体应答 E-GFP 报告基因的Hep G2 细胞系，可筛选此受体的激动剂。目前还有报道，将 GFP 与其它荧光蛋白形成荧光共振用于荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）实验。FRET 是指激发态的荧光分子通过偶极作用把激发态能量转移给吸收分子的现象，能够描述荧光供体蛋白和荧光受体蛋白之间非辐射的能量转移。FRET是观察生物大分子的新技术，可跟踪结构变化、分子解离程度及生物大分子之间的距离，对其相应的生物学功能进行定性、定量检测。随着使用材料、技术和方法的不断改进，近年 FRET 已用于药物筛选。Bevan 等[15]报道了用GFP的FRET实验描述γ-氨基丁酸GABA-B受体的2个亚单位的相互作用，通过此模型能筛选相应受体的调节剂。由于白细胞间介素-3（Interleukin-3, IL3）mRNA存在失稳的多AU元件（AU-rich element，ARE），因而是固有易变的。Benjamin 等[16]以GFP作报告基因将其融入全长IL3 3＇ UTR不翻译区构建了一个灵敏的报告系统，研究IL3 mRNA的退火和失稳。这个报告系统用来筛选和识别稳定ARE-mRNA的化合物。

四、展望

报告基因作为一种有效的技术手段目前已在农学、生物医学、生命科学和环境保护等领域发挥重要作用，它是目的物定位、表达、转移的风向标。随着技术的发展和研究的深入，报告基因种类的增多及检测方法的不断完善，在今后的研究中必将发挥更广泛的作用。绿色荧光蛋白作为一种新型的转基因植株报告基因，它的诸多优点如直接在长波紫外灯下发绿色荧光、利用立式荧光显微镜进行荧光检测等等，都值得对GFP融合蛋白做进一步的研究。它为便捷、迅速地检测转基因植株提供了一个很好的方法，并且可以根据需要，选择多种检测GFP方法中的一种进行检测。