基因工程之基因芯片的研究和应用

基因工程之基因芯片的研究和应用

班级：生物工程09—1 学号：54093020151 姓名：张志刚

基因工程之基因芯片的研究和应用

摘要：本文主要对基因芯片的概念、技术原理、分类、主要技术流程、应用及其存在的问题和应用前景作了综述。

关键词：基因芯片；基因组研究；基因诊断；技术流程

基因芯片技术自问世以来，由于其具有微型化、集约化和标准化的特点，在分子生物学研究、医学临床检验、生物制药领域和环境学等领域显示出了强大的生命力。现代生物学已进入了以功能基因为研究主体的后基因时代，确定基因的功能以及它在不同情况下的表达状况是利用基因的基础。传统的研究方法是通过分子生物学的手段克隆一个基因，然后用生物化学、遗传学以及生理学的手段研究它的功能，需要花费大量的人力物力。然而，大多数生命现象往往与多个基因有关，传统的方法就很难满足要求。生物芯片技术的出现使得大规模地分析基因的功能及其在各种情况下的表达状况成为可能。

1 概念及原理

1.1基因芯片的概念

基因芯片的概念来源于计算机芯片，又叫DNA芯片或寡核苷酸芯片，最早是由SouthemE．在1989年提出的，因芯片有许多同义词，如DNA芯片、DNA微集芯片、DNA阵列、DNA微集阵列，且DNA是一种寡核苷酸，所以也称为寡核苷酸阵列或芯片。基因芯片是指采用寡核苷酸原位合成或显微打印手段，将数以万计的DNA探针片段有序地固化于支持物表面上，产生二维DNA探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品的快速、并行、高效地检测或诊断。由于常用硅芯片作为固相支持物，且在制备过程中运用了计算机芯片的制备技术，所以称为DNA芯片技术。 1.2基因芯片技术原理

基因芯片技术是建立在基因探针和杂交测序技术上的一种高效快速的核酸序列分析手段。它将大量的基因探针有序地、高密度地排列在一块1～2cm2小的玻片或胶片上，形成可与目的分子相互作用的固相表面，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进行分析。它与其他分析基因表达谱的技术，如RNA印迹、cDNA文库序列测定、基因表达序列分析等的不同之处在于，基因芯片可以在一次试验中同时平行分析成千上万个基因。

2 基因芯片的分类

基因芯片产生得益于分子生物学、微电子技术、高分子化学合成技术、激光技术和计算机科学的发展及其有机结合。根据基因芯片制造过程所采用技术的不同，基因芯片主要分为四类。

2.1 光引导原位合成技术生产寡聚核苷酸微阵列

开发并掌握这一技术的是Affymetrix公司，Affymetrix采用了照相平板印刷技术结合光引导原位寡聚核苷酸合成技术制作DNA芯片，采用这种技术生产的基因芯片可以达到1×106／cm2的微探针排列密度，能够在一片1 cm2见方的片基上排列几百万个寡聚核苷酸探针。Affy—metrix公司生产的诊断用基因芯片根据用途可以分为三类：基因表达芯片、基因多态性分析芯片和疾病诊断芯片。基因表达分析芯片和基因多态性分析芯片主要用于寻找新基因、基因测序、疾病基因研究、基因制药研究、新药筛选等，Affy—metrix公司主要生产通用寡聚核苷酸芯片；疾病诊断芯片则主要用于医学临床诊断，包括各种遗传病和肿瘤等，目前商品化诊断芯片主要有p53基因突变诊断芯片、艾滋病病毒基因基因突变诊断芯片和细胞色素P450基因突变诊断芯片。 2.2微电子芯片

Nanogen公司开发了多位点电控阵列并含独立可寻址检测区域的微电子基 因芯片，无论在芯片制造或成品芯片检测，均可通过相似微电极的电场变化来 使核酸结合，可加快DNA杂交速率，通过引入“电子严谨度”参数使芯片可以检测靶、探针序列特征，同时按照使用者要求来控制杂交过程中的严格性。 2.3微量点样技术

目前大部分生产基因芯片的公司都是使用微量点样技术，生产的芯片不受 探针分子大小种类的限制。由于同时有生产和检测仪器出售，所以用户能够根 据自己的需要制作相应的芯片。生产这种设备的公司有很多，如美国的Genom． icsolutions公司、英国的BioRobotics公司、美国的Cartesian公司和加拿大的Engi． neefing公司等。

对于微量点样技术生产的基因芯片来说，从仪器组成上可以分为点样仪器、杂交装置、检测仪器和分析仪器。点样仪器是否先进决定了芯片上的探针密度和结合牢固程度，具体的点样密度根据使用者的目的来确定，而且还要考虑到随后

的杂交和检测过程。在检测仪器方面，对高密度的芯片通常使用激光共聚焦显微镜和高性能的冷却CCD来进行检测。所采用的显色和分析测定方法主要为荧光法，另外还有质谱法、化学发光法、光导纤维法等。 2.4其他技术

Orehidbio公司研制了一种毛细管微流泵芯片，不但可以用于基因诊断和分 析，还可用于合成化学。利用芯片的微指结构，Caliper公司的芯片可以用作细 胞分选器，能够利用血细胞体积和变形性等特点可以很容易地把红细胞和白细 胞分开。NIH研制微型芯片反应器可以很快地完成一系列生化反应。

3 基因芯片技术的基本步骤

3. l 基因芯片的制备 3. l. l 载体材料的选择

制作生物芯片的载体材料必须是固体片状或者薄膜，其表面带有活性基团如活氨基及生物素等，以便于连接并有效固定探针分子. 目前适用于DNA 芯片制作的载体材料主要有半导体硅片、玻璃片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等. 其中玻璃片最为常用。 3. l. 2 基因芯片的制备方法

根据探针固定方式的不同，基因芯片可以大致分为两类：原位合成芯片（synthetic genechip）和DNA 微集芯片（DNA microbaray。原位合成芯片是指直接在芯片片基上用4 种核苷酸合成所需探针制备而成. 主要包括：（l）显微光 蚀刻技术：结合了半导体工业的光刻技术和DNA 合成技术. 利用光保护基团修饰芯片表面碱基单体的活性羟基，通过设计特定的光刻掩膜和不断的更换曝光区域，直接在片基上合成所需探针阵列，探针数目呈指数增长. 但每步合成反应的产率低，且去保护不彻底会导致杂交信号模糊.（2）压电打印技术：原理类似于喷墨打印机，不过喷头和墨盒有多个. 墨盒中分别装上4 种碱基合成试剂，通过计算机控制将4 种碱基合成试剂打印到包被的支持物的预定区域上，经过冲洗、封闭、氧化和脱保护等常规的化学处理步骤循环的合成. 该法对探针的设计和制备比较灵活，成本较低，产率高，每步产率可达99%. 可合成出长度达40 ~ 50 个碱基的探针.DNA 微集芯片的制备是将预先合成好的探针通过点样机直接点在芯片片基上. 其探针来源主要是通过常规分子生物学技术制备：如PCR、RT -