质粒DNA及λDNA的酶切、连接、转化及重组子的筛选鉴定

质粒DNA及λDNA的酶切、连接、转化及重组子的筛选鉴定

一、【实验目的】

1、学习在实现DNA的体外重组过程中，如何正确选择合适的载体和限制性核酸内切酶，并利用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割；

2、学会设计构建重组DNA的基本方法并掌握载体和目的DNA酶切的操作技术； 3、学习利用T4-DNA连接酶连接载体片段和目的DNA片段，构建体外重组DNA； 4、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的原理与方法和热击法转化的原理和方法； 5、学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法； 6、学习并掌握使用试剂盒抽提质粒的方法及进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA片段。

二、【实验原理】

本阶段实验采用单酶切法，用限制性核酸内切酶Hind Ⅲ将上阶段实验中提取并用琼脂糖凝胶电泳验证了的大肠杆菌质粒DNA pUC19和买来的λDNA同时酶切，然后用DNA连接酶将上述酶切的质粒pUC19和λDNA在有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中连接起来，得到重组质粒。之后再将重组质粒导入到用CaCl2处理的大肠杆菌DH 5α感受态细胞中，经培养后，再将这些大肠杆菌涂布在麦康凯培养基中，通过α互补筛选法，根据菌落颜色筛选出重组子，并将其划线接种于加入氨苄青霉素的麦康凯培养基中进行验证，最后大量培养，并用试剂盒提取重组DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1、限制性核酸内切酶

限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序

列，并由此切割DNA双链结构的酶。主要是从原核生物中分离纯化出来的。根据1994年美国出版的《分子生物学百科全书》的统计数字，仅Ⅱ型核酸内切限制酶一项就已从各种不同的微生物当中，分离出了2300种以上、可识别230种不同的DNA序列。在核酸内切限制酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA由于修饰酶(通常是一种甲基化酶)的保护作用，则可免受限制酶的降解。

目前已经鉴定出3种不同类型的核酸内切限制酶，即Ⅰ型酶、II型酶和III型酶。Ⅱ型核酸内切限制酶具有3个基本的特性：①在DNA分子双链的特异性识别序列部位切割DNA分子，产生链的断裂；②2个单链断裂部位在DNA分子上的分布通常不是彼此直接相对的；③断裂结果形成的DNA片段往往具有互补的单链延伸末端。

限制性内切酶的切割方式：根据切割位点相对于对称轴的位置而言有三种，在对称轴5'侧切割产生5'粘端，在对称轴的3'侧切割产生3'粘端，在对称轴处切割产生平端。

核酸内切限制酶对DNA底物的酶解作用是否完全，直接关系到连接反应、重组体分子的筛选和鉴定等实验结果。核酸内切限制酶活性的充分发挥受到以下几个因索的影响：1）DNA样品的纯度，2）DNA的甲基化程度，3）酶切消化反应的温度，4）DNA的分子结构，5）核酸内切限制酶的缓冲液。

内切酶的星号活性：内切酶通常有严格的识别特异性，能精确地识别DNA排列顺序。但在某些反应条件下，识别顺序的特异性可能发生变化。结果一种内切酶酶切同一种DNA片段会产生新的酶切位点，得到不同的酶切片段，这就是内切酶的星号活性。最常见的例子是EcoR I，一般条件下它识别GAATTC六个核苷酸顺序，而EcoR I(表现有星号活性)，仅能识别AATT四个核苷酸的顺序。在这种条件下的酶解反应，电泳后出现的DNA条带数可能增多。

促使内切酶产生星号活性的因素有多种，主要由如下一些因素引起：（1）甘油浓度过高。这是引起星号反应的常见原因。（2）离子强度不合适。盐浓度降低也可能引起星号反应。（3）阳离子变化。若将Mg2+改为Mn2+可能促使EcoRⅠ和HindⅢ产生星号活性。（4）溶液中pH变化。如用EcoR I酶切时，反应溶液的pH值由7.5升高到8.5时也会出现星号反应。（5）有机溶剂残留的影响。 2、酶切方法

体外构建重组 DNA 分子，首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限

制性核 酸内切酶都不能在目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或者两种限制性 核酸内切酶切割外源供体 DNA 时，能够得到完整的目的基因。其次，选择具有相 应的单一酶切位点的质粒、噬菌体等载体分子再为克隆的载体。常用的酶切方法 有双酶切法和单酶切法两种。

3、DNA连接酶

1967年，世界上有几个实验室几乎同时发现了一种能够催化2条DNA分子之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶(Iigase)。这种酶能够参与DNA裂口的修复，在一定条件下还能连接DNA分子的自由末端。连接的功能是通过合成相邻核苷酸之间的磷酸二酯键，从而修复缺口(nick)或单链的裂口(gap)。

DNA连接酶能催化双链DNA片段紧靠在一起的3'羟基末端与5'磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接。目前用于连接DNA片段的DNA连接酶有E. coli DNA连接酶和T4DNA连接酶。DNA连接酶只能催化双链DNA片段互补黏性末端之间的连接，不能催化双链DNA片段平末端之间的连接。T4DNA连接酶既可用于双链DNA片段互补黏性末端之间的连接，也能催化双链DNA片段平末端之间的连接，但平末端之间连接的效率比较低。

DNA连接酶同核酸内切限制酶一样，都是在体外构建重组DNA分子所必不可少的基本工具酶。核酸内切限制酶可以将DNA分子切割成不同大小的片段，然而要将不同来源的DNA片段组成新的杂种DNA分子，还必须将它们彼此连接起来。目前有3种体外连接DNA片段的方法：①用DNA连接酶连接具有互补黏性末端的DNA片段；②用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来，或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片段加上poly(dA)-poly(dT)尾之后，再用DNA连接酶连接起来；③先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成黏性末端，再用DNA连接酶连接起来。这3种方法虽然互有差异，但共同的一点都是利用DNA连接酶所具有的连接和封闭单链DNA的功能。

4、连接反应

外源 DNA 片段与载体分子连接的方法，即 DNA 分子体外重组技术，主要依赖 于核酸内切限制酶和 DNA 连接酶催化完成的。DNA 连接酶催化两双链 DNA 片段相 邻的 5’-磷酸和 3’-羟基间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的 DNA 连接 酶是来自 T4 噬菌体的 DNA 连接酶：T4-DNA 连接酶，该酶需要 ATP 作为辅助因子。

5、感受态细胞的制备及质粒转化

构建好的重组DNA转入感受态细胞中进行表达的现象就是转化。能进行转化的受体细胞必须是感受态细胞，即受体细胞最容易接受外源DNA片段实现转化的生理状态，它决定于受体菌的遗传特性，同时与菌龄、外界环境等因素有关。人工转化是通过人为诱导的方法使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内，该过程与细菌自身的遗传控制无关，常用热击法，电穿孔法等。能否实现质粒DNA的转化还与受体细胞的遗传特性有关，所用的受体细胞一般是限制修饰系统的缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。

目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2法，制备好的感受态细胞可以加入终浓度为15%的无菌甘油，-70℃可保存半年至一年。经过CaCl2处理的细胞细胞膜通透性增加，允许外源DNA分子进入。在低温下，将携带有外源DNA片段的载体与感受态细胞混合，经过热击或电穿孔技术，使载体分子进入细胞。进入受体细胞的外源DNA分子通过复制、表达，使受体细胞出现新的遗传性状。将这些转化后的细胞在选择性培养基上培养，即可筛选出重组子。本实验以E.coli DH 5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理，使其处于感受态，然后将重组后的PUC19质粒在42℃下热击90s，实现转化。

6、重组子的筛选鉴定

重组DNA转化到宿主细胞后，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞，同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子之后能良好增殖。并且它们是与其他大量未被转化的受体菌细胞混杂在一起。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们所期待的重组DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成非期待重组DNA分子导入所致。因此必须使用各种筛选及鉴定手段区分转化子与非转化子，并从转化的细胞群体中分离出带有目的基因的重组子。本实验中采用的方法是平板筛选法和电泳检测。

抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选，而不含重组质粒DNA分子的受体菌则不能存活，质粒pUC19携带有氨苄青霉素抗性基因，在含有氨苄青霉素平板上筛选转化子。没有导入质粒pUC19的受体细胞，在含有氨苄青

霉素的平板上不生长。α互补筛选法根据菌落颜色筛选含有重组质粒的转化子，利用β -半乳糖苷酶筛选系统来选择。载体上带有一个来自大肠杆菌的 lac 操纵子的 DNA 区段，这一区段编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个蛋白片段。IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)可以诱导该片段的合成，而该片段能与宿主细胞所编码的β-半乳糖苷酶羧基端的一个蛋白片段互补(α互补)。故暴露于诱导物 IPTG 的细菌含有编码 lacZ 基因的质粒可同时合成该酶的两种片段，该菌在麦康凯培养基上利用乳糖产酸生成红色菌落。 将多克隆位点克隆入β-半乳糖苷酶氨基端的基因中，外源 DNA 插人质粒的多克 隆位点后可使β-半乳糖苷酶氨基端片段灭活，从而破坏了α互补作用。带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。利用这种筛选方法可方便地将含目的基因的重组子筛选出来。挑选在氨苄青霉素培养基上生长的白色菌落，通过扩增培养。因为许多菌落存在假阳性情况，在氨苄青霉素培养基上的白色菌落可能是导入的重组载体DNA菌落，也可能是载体自连后发生突变的菌落，所以还要鉴定转化子中重组质粒DNA分子的大小，可将重组的载体DNA提取出来，进行后续的酶切、电泳检验。如下图为质粒pUC19酶切图谱：

质粒pUC19的酶切图谱分析

三、【实验材料及仪器】