实验二 细菌培养与代谢产物检查

实验二 细菌培养与代谢产物检查

【目的】

①学习并初步掌握基础培养基制备方法。

②了解细菌生长繁殖所需要营养以及常用培养基的种类和用途。

③了解细菌所具有的不同生化反应及代谢产物，以利细菌的鉴定和鉴别。 ④规范地进行无菌操作。

一、基础培养基的制备

(一)培养基的制作程序

培养基制作的一般程序：准确称量培养基的各种成分→混合溶解→测定及矫正pH→分装、包装→灭菌→检定→保存备用。

(二)常用培养基的种类 按培养基的作用分为： ①基础培养基：含有细菌需要的最基本营养成分(蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，氯化钠0.5％，用蒸馏水溶解)。按其性状不同可分为：(1)肉汤培养基。(2)普通琼脂培养基。分斜面和平板培养基，内含2～3％的琼脂，呈固体状。(3)半固体培养基，含0.2～0.5％的琼脂。

②营养培养基：供营养要求较高的细菌用，如血琼脂培养基(在普通琼脂培养基中加入5％～10％的脱纤维动物血)。

③选择培养基：如SS琼脂培养基，可选择性抑制非病原菌生长，有利于分离病原菌。

④鉴别培养基：如含铁双糖培养基，用以鉴定细菌。 ⑤厌氧培养基：如庖肉培养基，用以培养厌氧菌。 (三)基础培养基的制备过程 1、肉汤(肉浸液)培养基 【材料】

牛肉、蛋白胨、氯化钠、水(蒸馏水或自来水)、NaOH溶液(1N和N／10)、0.02％酚红指示剂、吸管等。

【方法】

①取新鲜瘦牛肉，除去脂肪及筋膜，切成小块后用绞肉机绞碎，每500g碎肉加水1000ml，混合置4℃冰箱过夜(使营养物质即溶解性蛋白质充分渗出)。

②次日取出煮沸半小时左右，使肉渣蛋白质全部凝固；加热过程中不时地用玻璃棒搅拌，以免沉淀烧焦。也可不放置冰箱过夜，直接煮沸1小时。

③用数层纱布过滤，弃去肉渣(肉渣中的液体应尽量挤净)，于滤液中加入1％蛋白胨及0.5％氯化钠，加热溶解，并补足失水至1000ml。

④冷却到50℃在右，以N／10 NaOH调至pH值7.6～7.8。

⑤待pH矫正后，再加热10min，使肉汤中部分蛋白质等因加碱及再度加热而凝固沉淀。过滤并补足失水，重复矫正pH值—次，

⑥将上述制备的肉汤分装于烧瓶或试管中，瓶口或管口加塞并包扎，经103.34kPa(15磅)20min高压灭菌后，置冰箱中或干燥阴凉处备用。

【用途】

用作基础培养基，其营养比肉膏汤好，一般营养要求不高的细菌均可生长。 2、肉膏汤培养基

牛肉膏系将牛肉汤加热浓缩而成，每1000毫升能浓缩成肉膏约70克。牛肉膏汤可代替牛肉汤来培养细菌，由于经长时间加热，部分营养成分(如糖分)已损失，故其营养价值略低于牛肉汤。但肉膏汤制作手续简单，制品透明清晰，酸碱度变化较小，故仍常用。

【材料】

牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、水、氢氧化钠溶液、0.02％酚红指示剂、吸管等。 【方法】

①将牛肉膏3～5g、蛋白胨10g、氯化钠5g加于1000ml水中，用玻棒搅拌使其溶解。必要时加热使其溶解。

②矫正至pH7.4～7.6，煮沸3～5min，过滤。

③分装于适当容器内，高压灭菌15磅20min，置冰箱中或干燥阴凉处备用。 【用途】供一般细菌培养用。 3、肉汤琼脂固体培养基 琼脂是海藻糖中提取出的一种多糖类物质，对病原性细菌无营养作用。加入培养基的目的是使之固态化，因其熔化点为100℃，凝固点约40℃，利用此特性，加至肉汤或肉膏汤内后，趁热可制得斜面，平板等不同类型的固体培养基，以供分离培养、繁殖细菌等用。

【材料】

pH7.6牛肉汤或牛肉膏汤、琼脂、空试管、灭菌培养皿(9cm直径)。 【方法】

①于pH 7.6的牛肉汤或牛肉膏汤中，加入2～3％琼脂，加热溶化。 ②以脱脂棉过滤去除杂质(或不过滤)，分装烧瓶或试管(琼脂斜面每管5m1)。

③经15磅20min高压灭菌后，趁热将装有5ml肉汤琼脂之试管斜置，待冷凝后即成琼脂斜面培养基。高层琼脂的分装量约为试管长度的1／4或1／3；若接种厌氧菌则应为试管长度的2／3。烧瓶中肉汤琼脂冷至50～60℃时，以无菌操作法将其倾入灭菌空培养皿中(每皿15～20ml)，迅速盖上皿盖，并将培养皿于桌面轻轻回转摇动，使皿内培养基平铺皿底，待冷凝后即成琼脂平板培养基。

【用途】

①琼脂斜面培养基用于纯种细菌接种以保存一般菌种。 ②琼脂平板培养基用于细菌的分离培养。

4、肉汤琼脂半固体培养基

【材料】

pH7.6的牛肉汤或牛肉膏汤、琼脂、空小试管(10×100mm)。 【方法】

①于pH7.6的牛肉汤或牛肉膏汤中，加入0.3～0.5％琼脂，加热溶化后，过滤并补足失水。

②分装于小试管中，每管3ml，经15磅20min高压灭菌后直立冷凝即成。 【用途】

常用于细菌的动力检查和菌种保存。 5、干燥培养基

干燥培养基是将新鲜配制的液体培养基用喷雾、真空、低温、蒸发等干燥方法，将培养基内水分去掉后形成各种固形成分，经过适当处理使成干燥粉末状。用时只要按一定比例加入一定量的蒸馏水，经过溶解、分装、高压灭菌即可应用。其优点是节省时间、使用方便。

二、细菌的接种法

(一)分离培养法

细菌种类多且分布广，因此临床标本如粪便、痰、脓等以及水、牛乳中常含有多种细菌。应用分离培养法可获得检材中某一种细菌，亦可使被污染的菌种重新分纯。

【材料】

葡萄球菌和大肠埃希菌的混合菌液、普通琼脂平板。 【方法】

当标本中含有两种以上细菌时，可用平板划线接种法。划线方法很多，平板分离划线接种为常用的分离培养法，最后均使混杂的细菌在琼脂平板表面分散，形成菌苔；或者使单个细菌固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落而得到纯种细菌。操作方法：①右手持接种环，火焰灭菌后，挑取待分离标本一环；②左手持琼脂平板，以左手拇指和食指将平板盖开启，右手将沾有检材之接种环伸入平板，与平板培养基表面成45°角，如图所示，在培养基表面分区划线(每区划线后，接种环都须经火焰灭菌)，盖好平板。最后接种环火焰灭菌；③在平板底上标好组别、姓名、日期等(标签纸写好后贴上)。④将平板底朝上、盖朝下放入37℃温箱中培养，24小时后观察结果。

平板划线接种法

【观察结果】

观察琼脂平板培养基表面菌苔以及单个菌落生长情况，即观察琼脂平板培养基表面单个菌落的大小、形状、突起、边缘、菌落表面、湿润度、透明度及颜色

等性状。挑取单个菌落可获得纯培养。

(二)纯种细菌培养法

各种检材经分离培养得纯种细菌后，若需保留菌种或进一步测试其生化反应等生物学特性时，必须进行纯种细菌培养。根据常用培养基的物理性状，纯种细菌培养接种法有以下几种。

1、琼脂斜面培养基接种法

凡具有斜面外形的的固体培养基均采用此种方法接种细菌。 【材料】

琼脂斜面培养基、大肠埃希菌琼脂斜面18～24小时培养物。

【方法】

①右手持接种环，火焰灭菌后，在琼脂板上挑取单个典型可疑菌落少许； ②左手持斜面培养基试管，右手掌和小指拨出棉塞，将挑有细菌的接种环伸入试管内。

③在培养基表面划线后，塞好棉塞，接种环火焰灭菌；放入37℃孵育24小时后观察。

④预先在试管1/3处标好组别、姓名、日期等。

琼脂斜面接种法

【观察结果】

观察斜面表面菌苔生长情况。

2、半固体培养基接种法

半固体琼脂培养基、醋酸铅培养基及明胶培养基等均用本法接种细菌。 【材料】

半固体琼脂培养基、痢疾志贺菌及大肠埃希菌斜面培养物。 【方法】

右手持接种针，火焰灭菌后，挑取菌落或菌苔少许，垂直刺入半固体培养基的中央，深入管内培养基的3/4处，再循原穿刺线退出。放入37℃孵育24小时后观察。

【观察结果】

观察细菌能否运动。有鞭毛菌能运动，细菌沿穿刺线扩散生长，使培养基呈毛玻璃样混浊；而无鞭毛菌则不能运动，细菌沿穿刺线生长，其周围培养基仍为原来的透明度。

液体培养基、半固体培养基接种法