基因工程考试题库(便携版)资料

片段。 T-DNA区： 即转移DNA，能转移并整合在植物细胞核基因组上的、决

定植物形成冠瘿瘤的一段DNA。LTS和RTS对于T-DNA的转移和整合名词解释 是不可缺少的。 同裂酶（同切点酶）：有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷α-互补 ：指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整酸靶序列，这类酶称为同裂酶。 的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，由 1024同尾酶：与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它们来源各异，识别的个氨基酸组成）阴性的突变体之间实现互补。 靶序列也各不相同,但切割后都能产生相同的黏性末端,特称为同尾11. cos序列（cohesive endsite）：λDNA分子两端各有12碱基(5′酶。 -GGGCGGCGACCT-3′)的单链互补粘性末端，当λ噬菌体进入细菌测序酶：是经修饰过的T7噬菌体DNA聚合酶，是采用缺失的方法，细胞后，其DNA可迅速按碱基互补配对结合形成双链环状DNA分从外切核酸酶结构域中除去28个氨基酸，这样使得T7DNA聚合酶完子。 全失去了3~-5~外切酶活性，只有5~-3~聚合酶活性，而且聚合能力COS位点：当λDNA进入细菌细胞后，便迅速粘性末端配对形成双链很强，测序时常用此酶。与klenow相比优点是：是双脱氧链终止法环状DNA分子，这种粘性末端结合形成的双链区域叫做COS位点. 对长片段进行测序的理想用酶。 13. 端粒重复序列（telomeric repeat，TEL）：定位于染色体末端一段限制性核酸内切酶：是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基系序列，用于保护线状的DNA不被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的列的核酸水解酶。 结构。 限制-修饰系统中的限制和修饰作用：限制-修饰系统中的限制作用是14. 自主复制序列：一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA进行双向指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如复制所必须的信号。 噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制；而生物22. 多克隆位点：含有紧密排列的多个限制性内切酶识别位点的一段细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的作用，在碱基中DNA片段。 特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破23、分子杂交：是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法，用坏，这就是限制-修饰系统中的修饰作用。 于检测混合样品中特定核酸分子或蛋白质分子是否存在及其分子量5. 限制性片段长度多态性（RFLP）：当DNA序列的差异发生在限制大小。 性内切酶的识别位点时，或当DNA片段的插入、缺失或重复导致基24、菌落原位杂交：是将菌落或噬菌斑转到固相膜上，原位裂解细胞因组DNA经限制性内切酶酶解后，其片段长度的改变可以经过凝胶后使核酸固定在膜上，然后与探针杂交。用标记的核酸探针，经放射电泳区分，出现的这种DNA多态性称为限制性片段长度多态性。 自显影或非放射检测体系，在组织细胞间期染色体上对核酸进行定位6. 星号活性：限制性内切核酸酶识别和切割特异性位点是在特定的和相对定量研究的一种手段。 条件下测定的。当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，导致识别26、真核细胞原位杂交：是一项组织化学与分子杂交相结合的技术，与切割序列的非特异性，这种现象称为星号活性。（“非最适的”反应使探针与固定在载玻片上的细胞组织切片内的变性染色体杂交。 条件例如高浓度的核酸内切限制酶、高浓度的甘油、低离子强度、用27、荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）：对寡Mn2+取代Mg2+以及高pH值等。)克服星号活性的方法：维持反应体核苷酸探针做特殊的修饰和标记，后用原位杂交方法与靶染色体或系适当的离子强度、较低的温度或酶浓度，尽可能缩短反应时间或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相偶联的单克隆抗体DNA 样品的重新处理等。 （单个细胞增殖形成的细胞群所产生的抗体）来确定该DNA序列在7. 载体(vector): 在基因操作中携带外源基因进入受体细胞的工具。 染色体上的位置。 克隆载体：主要用于扩增或保存DNA片段，是最简单的载体。主要28、凝胶阻滞试验：（gel retardation assay）：又叫DNA迁移率变有：质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体、人工染色体（YAC和BAC）。 动试验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA），是用于YAC（酵母人工染色体）：是利用酿酒酵母的染色体的复制元件构建的体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。 载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。 26. 盒式诱变：就是用一段人工合成具有突变序列的DNA片段，取BAC（细菌人工染色体）：是基于大肠杆菌（E.coli）的F质粒构建的代野生型基因中的相应序列。这就好象用各种不同的盒式磁带插入收高通量低拷贝的质粒载体。 录机中一样，故而称合成的片段为“盒”，这种诱变方式为盒式诱变。 表达载体是可携带外源基因进入宿主细胞进行复制并进行转录、翻译27. 定点诱变（寡核苷酸介导；重叠延伸PCR、大引物PCR）：的载体。 （site-directed mutagenesis）是使已克隆基因或DNA片段中任何病毒表达载体：是以病毒基因组序列为基础，插入必要的表达元件所一个特定碱基发生取代、插入或缺失突变的过程。 构建成的真核基因转移工具。 27、体外随机诱变：指随机的在克隆化DNA中引入碱基置换突变。 T-载体：Taq酶的末端转移酶活性可在PCR产物的3’端加上一个不28、探针：指用于检测特定基因或转录产物存在或表达的DNA、RNA依赖于模板的A，根据这一特性，为方便进行PCR产物的直接克隆或寡核苷酸序列，这些序列在使用之前需标记。 而开发出T-载体。 29、DNase I足迹试验：DNase I足迹试验是一种鉴别RNA聚合酶等Ti质粒（tumor inducing plasmid）：是在根癌农杆菌中发现的可决蛋白质在DNA上结合位点的方法，它不仅能找到与特异性DNA结定冠瘿病（即可诱发寄主植物产生冠瘿瘤）的质粒。大小在200kb左合的目标蛋白，而且能告知目标蛋白结合在哪些碱基部位。 右。 30. 衔接物：是指人工合成的由10~12nt组成的、具有一个或数个限12. 粘粒载体：由人工构建的、大小一般在 5~7kb左右、含有λDNA制性内切核酸酸识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。 此方法的cos序列和质粒复制子的一类特殊的质粒载体。 适用于没有衔接物限制性内切核酸酶酶切位点的外源DNA片段。 17.一元载体：含目的DNA的中间表达载体与改造后的受体（Ti质粒）DNA接头（人工接头）:是指人工合成的含有限制酶识别顺序的核苷通过同源重组所产生的一种复合型载体。 酸片段。人工合成的一类具有某种限制性内切酶粘性末端，另一头为18.双元载体：是指由两个分别含有T-DNA和vir区的相容性突变Ti平末端的双链寡核苷酸片段。 质粒构成的系统。 31. 接头分子连接法（DNA接头连接法）：将具有平末端的外源DNA16. 卸甲载体：将Ti质粒上的T-DNA的致瘤基因全部去掉，仅保留片段与人工接头分子在T4 DNA连接酶的作用下连接起来；然后与具其两边界及与T-DNA转移所必需的25bp序列而构建成的载体。 有同样粘性末端的载体DNA分子在T4 DNA连接酶作用下连接成重8.质粒的相容性：是指两种质粒是否可以共存于同一个细胞，如果能组体。 够共存则叫相容又叫亲和。 32. 转化（transformation）：把重组质粒DNA导入受体细胞（大肠质粒的不相容性：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象，出现这种杆菌、酵母、动植物细胞等）,使其遗传性状改变的过程。 现象的原因主要是它们常常共用同一复制系统。 转染（transfection）:把重组的噬菌体或病毒导入受体细胞的过程。 9. 转移性：质粒具转移性是指在自然条件下，很多质粒可以通过称相互关系：转化一词严格地说是指，感受态的大肠杆菌细胞捕获和表为细菌接合的作用转移到新宿主内。不含tra基因的质粒则不具备转达质粒载体DNA分子的生命过程；而转染一词，则是专指感受态的大移性。 肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程。但从本质上讲，T-DNA ：能导入宿主细胞并插入其DNA中发挥作用的Ti质粒部分DNA两者并没有什么根本的差别。无论转化还是转染，其关键的因素都是基因工程考试题库（便携版）

用氯化钙处理大肠杆菌细胞，以提高膜的通透性，从而使外源DNA分RAPD技术：是建立在PCR基础之上的一种可对整个未知序列的基因组子能够容易地进入细胞内部。 进行多态性分析的分子技术。其以基因组DNA为模板,以单个人工合成33.转化子（transformant）：经转化获得外源遗传物质/DNA的细胞，的随机多态核苷酸序列(通常为10nt)为引物,在Taq酶作用下,进行是向有功能缺陷的细胞补充相应功能。 PCR扩增。 34、感受态（competence）：作为受体细胞的细菌经一定处理 (如冰AFLP：以PCR为基础，结合了RFLP、RAPD的分子标记技术。把DNA进行冷的CaCl2溶液）后处于易于接受外源DNA的状态。 限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增(在所有的限制35. “选择（selection）” ，是指通过某种外来附加压力（或因素）的性片段两端加上带有特定序列的“接头”，用与接头互补的但3′端辨别作用，呈现具有重组DNA分子的特定克隆类型的一种方法。 有3个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增，只有那些与3′端“筛选（screening）”则是指通过某种特定的方法，从被分析的细胞群严格配对的片段才能得到扩增)，再在有高分辨力聚丙烯酰胺凝胶电体或基因文库中，鉴定出真正具有所需要重组DNA分子的特定克隆泳进行PCR产物分离分开这些扩增产物，从而产生DNA指纹，用荧光法的过程。 或银染染色法均可检测之。 36. 启动子：是RNA聚合酶识别和结合的一段DNA序列，位于基因RT-PCR：以反转录的cDNA作模板所进行的PCR反应，可用于测定基因的上游。是基因表达调控的重要顺式元件，具有以下特征：①序列特表达的强度，还可用于鉴定已转录序列是否发生突变及呈现多态性，异性；②方向性；③位置特异性；④种属特异性 克隆mRNA的5'和3'末端序列，从非常少量的mRNA样品构建大容量的37.增强子：是能够增强启动子转录活性的一段DNA序列，由多个元cDNA文库。 件组成，每一个元件可以与一种或多种转录调控因子结合。 53、松弛型质粒：细菌细胞中质粒的数目有很大差异。多的每个细胞38.沉默子(silencer)：是参与基因表达负调控的一种元件（降低转录里可以达几十乃至几百份拷贝，少的则只有一到几份拷贝。高拷贝数效率的一段DNA） 的质粒称为松弛型质粒，有的质粒拷贝数较多，可随时复制，与染色39.绝缘子(insulator)：既是基因表达的调控元件也是一种边界元件。体的复制不相关，称为松弛型质粒。

绝缘子本身对基因的表达既没有正效应，也没有负效应，其作用只是55、亚克隆：对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，即将已克隆不让其他调控元件对基因的活化效应或失活效应发生作用。 的DNA片段从一载体向另一载体的转移的过程。目的在于对目的DNA40.衰减子（attenuator）:衰减发生处的一种内部终止子序列。衰减子进行进一步分析，或者进行重组改照等。 结构本身不能实现衰减作用，必须借助核糖体与前导序列的结合来发56、核酸疫苗：核酸疫苗又称基因疫苗或DNA疫苗，是利用基因重组挥其作用。 技术将编码抗原的基因装入载体，然后直接导入动物体内，通过机体41.终止子:为转录提供终止信号的一段DNA序列，是基因表达的顺细胞的转录系统合成蛋白，产生的蛋白作为抗原诱导免疫系统产生免式负调控元件。 疫应答，即通过细胞和体液免疫反应产生抗体，从而达到预防和治疗42. 目的基因：指那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的疾病的目的。 特定基因或DNA 片段。 基因工程疫苗：将基因工程技术应用于疫苗生产所得的疫苗即为基因融合基因：是指应用DNA体外重组技术构建的一类具有来自两个或两工程疫苗。疫苗一般是由灭活或减毒的病原体做成的可预防相应病原个以上的不同基因核苷酸系列的新型基因。 物引起疾病的药物, 通过接种人或动物在其体内建立抗感染免疫反报告基因：是指编码产物能够被快速测定、常用于判断外源基因是否应而产生保护作用. 成功地导入受体细胞（器官或组织），是否表达的一类特殊用途的基58、基因组文库：某种生物的全部基因组的遗传信息通过克隆载体储因。 存在可以长期保存的稳定的重组体中，以备需要时能够随时应用它分44、报告基因与选择基因的区别： 选择基因往往要与外界存在的筛离所需要的目的基因，这种含有某种生物全部基因组遗传信息的重组选压力如抗生素等相互作用，以筛选出被转化的细胞；而报告基因是体即为这种生物的基因组文库。 提供一种快速测定外源基因是否成功导入的检测手段，它的应用不依cDNA文库：将一种生物mRNA,经反转录产生cDNA,以cDNA构建赖于外界选择压力的存在。 的克隆群体叫做该种生物的cDNA文库.。

44.代表性差异分析：利用了PCR以指数形式扩增双链模板，而以线45.复杂基因病：不是由于某一个基因核苷酸序列的改变造成基因编形形式扩增单链模板的特性，设计独特的接头和引物，扣除共有序列，码错误而引起疾病，而可能是由于基因“控制失调”所致。 以指数形式扩增特有序列，通过消减和富集，使得目的基因得到特异基因治疗：是向有功能缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿性扩增的一种基因克隆的方法。 其基因缺陷，达到治疗目的的方法。

48、2цm质粒：是酿酒酵母含有一个长度为2微米的内源质粒，它46 基因芯片：又称DNA芯片或DNA微阵列。即在玻片、硅片、薄膜的DNA分子通常与蛋白质结合构成复合物，存在于核区。2微米质粒等载体很小的基质表面上有序地、高密度地（点与点之间的距离一般含有自主复制起始区和STB区，STB系列能够使质粒在供体细胞中维小于500цm）排列、固定了大量的靶DNA片段或寡核苷酸片段。这持稳定。 些被固定的DNA分子在基质上形成的高密度DNA微阵列则称为DNA芯49、mRNA差异技术：也是利用基因在一些组织或器官中的特异表达片。 的原理，将两种组织的mRNA提取出来，通过反转录和进行电泳，找RDA 和 SSH ： RDA不能解决高丰度序列对低丰度序列富集的干扰，出差异的带。 因此通常需要进行多轮的扣除杂交过程。针对此缺陷，199650、动物生物反应器：从转基因动物体液或血液中收获基因产物即是年,Diachenko等人在RDA的基础上发展出了SSH技术。SSH在保留所谓的动物生物反应器。 RDA的差减富集和动力学富集因素的同时，通过在杂交之前对cDNA51、转基因动物：指用人工的方法将外源基因导入动物受精卵或早期的丰度进行均一化处理，使丰度上有差别的单链cDNA相对含量基本胚胎细胞，使外源基因与动物本身的基因整合，并随细胞的分裂而增一致，从而解决了高丰度序列对低丰度序列富集的干扰。 殖，从而将外源基因稳定地遗传给下一代的工程化动物。 转座子标签技术/T-DNA标签技术：当转座子或T-DNA转入生物基因52、原位PCR：是指对组织、细胞中特异DNA或RNA进行扩增，然后组,整合到染色体上的时候,有可能是插入到染色体上的某个基因中,再用原位杂交对扩增产物进行定量分析的一种方法。不需抽提组织细这时会破坏该基因的结构，从而引起表型变异，把变异个体的DNA提胞中的核酸，形态结构不被破坏；与探针原位杂交相比，灵敏度一般取出来，构建成基因组文库，再用转座子或T-DNA为模板制备探针，可提高100倍左右。 克隆出该突变基因，再用该突变基因作探针从野生型个体中克隆出目反向PCR：用已知片段内部没有的限制性内切酶切割模板DNA，再将酶的基因。目的基因：指那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表切后的DNA片段连接成环状分子，其中至少有一个环状分子含有完整达的特定基因或DNA 片段。 的已知片段。根据已知片段两端的序列设计引物，可将邻近的DNA片Randomprimer随机引物，对于一段待测的未知序列DNA片段，往往已段扩增出来。 装载在载体上，因此待测DNA片段的两端相当于添加了已知的载体片平台效应：在PCR反应后期，产物的积累按减弱的指数速率增长。原段。这样就可以根据载体序列设计的通用引物测定待测DNA片段两端因： ①底物浓度因消耗而降低，dNTPorprimers，掺入速度减慢； ②的序列。 dNTP或酶的稳定性下降③末端产物抑制（焦磷酸、dsDNA）④非特异Primerwalking引物步移，引物依次推进法是从目的片段（在待测片性竞争（非特异性引物或引物二聚体）⑤特异性产物自身复性（＞段中若知道部分核苷酸序列）的一端开始，利用载体上的序列为依据，10-8M）⑥高浓度产物下，变性不彻底。 设计第一次反应的反应引物进行测序，然后，依次根据前一次测序结

果，设计下一次反应引物，递进测序，直至完成。 ddNTP: 与普通的dNTP不同之处在于ddNTP脱氧核糖的3’端位置的羟基缺失，它们可以在DNA聚合酶的作用下，通过DNA聚合酶其掺入到正在增长中的DNA链中，因自身脱氧核糖的3’位置的羟基缺失导致链延伸反应终止。 7、生产限制性内切酶的细菌如何保护自己的DNA不被降解？ 答：通过限制与修饰系统保护自己的DNA不被降解。几乎所有的限制性内切核酸酶都能和识别甲基相同DNA位点的甲基转移酶共同作用，构成限制修饰系统。由于宿主自身DNA上的这些位点进行了修饰，限制酶就不能进行切割。由于外来的DNA在相应的碱基上没有被甲基化，宿主的限制酶通过对该位点的识别来分辨敌我，并将入侵的外来基因克隆、基因操作、基因重组、基因工程的概念及其相互联系。 DNA分子降解掉。所以DNA限制作用和修饰作用为细胞提供了保护。 答：基因克隆（Genecloning）：是指对基因进行分离和扩大繁殖等操8、按适当的顺序，列出将一种mRNA的cDNA克隆到表达载体所用到作过程，其目的在于获得大量的基因拷贝，在技术上主要包括载体构的酶有哪些？ 建、大肠杆菌遗传转化、重组子筛选和扩大繁殖等环节。 答：1、反转录酶以mRNA为模板复制出单链cDNA；2、DNA聚合酶以基因工程：是通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连单链cDNA为模板合成双链DNA；3、S1核酸酶切割双链DNA形成平末接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白端；4、用限制性内切酶切割载体；5、用DNA连接酶将cDNA插入载质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状的操作。 体。 基因操作：对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移9、某学生在用EcoRI切割外源DNA片段时出现了星号活性，分析可等操作的总称。 能的原因？ 基因重组：不同来源DNA分子通过共价连接（磷酸二酯键）而组合成答：(1)高甘油含量(>5％,v／v)；(2)限制性内切核酸酶用量过高新的DNA分子的过程。 (>100U／ugDNA)；(3)低离子强度(<25mmol／L)；(4)高pH(8．0以上)；2+它们的相互关系：基因工程是通过基因重组实现的，但基因重组(5)含有有机溶剂，如DMSO，乙醇等；(6)有无Mg的二价阳离子存在2+2+2+2+并不都是严格意义上的基因工程，基因重组是基因操作范畴的概念，(如Mn，Cu，C0，Zn等)；（7）温度过高；（8）反应时间过长。 包括实验研究和生物技术的基因重组事件，而基因工程则专指为实践10、为什么反转录酶在聚合反应中会出错？ 应用而进行的重组事件。基因操作是基因工程的技术基础；基因克隆答：因为反转录酶无3′→5′外切酶校正作用，聚合反应往往出错。2+很多时候并不涉及遗传的改良。在高浓度的dNTP和Mn存在时错误率为1/500b。 2＋2＋1、试述基因工程技术的发展给人类带来的影响？ 11、Mn、Mg对DNaseI的活性有什么影响？DNaseI在基因工程中答：1、在工业领域的应用（第四次工业大革命）2、在农业领域的应有什么作用？ 2＋用3、在医药领域的应用（第二次医学大革命） 答：在Mg存在下，独立作用于每条DNA链，且切割位点随机；在2＋46、基因工程建立的理论基础合技术基础： Mn存在下，可在两条链大致同一位置切割dsDNA，产生平末端或1～理论上的三大发现： 证明了生物的遗传物质是DNA（基因工程的先2nt突出的DNA片段。作用：切口平移标记时在dsDNA上产生随机切导）； DNA的双螺旋结构和半保留复制机理；遗传信息的传递方式口；在闭环DNA上引入单切口；在DNA酶足迹法中分析蛋白/DNA复（中心法则）和三联体密码子系统的建立。 合物；去除RNA样品中的DNA。 技术上的三大发现：限制性内切酶和DNA连接酶的发现；载体的使用；11.限制性核酸内切酶Bam HI和PstI切割某DNA序列，结果示于下大肠杆菌转化体系的建立。 图： 2、试述基因工程技术的发展方向？ 答：生物的遗传改良，生物反应器、基因治疗和基因疫苗等。 3、简述基因工程的基本过程和四个基本条件？ 答：1、目的基因克隆；2、载体的准备；3、目的基因和载体的连接；4、重组DNA转化/转染/转导；5、重组体的筛选与鉴定；6、重组体

的大量培养，外源基因表达效应分析与开发利用。四个基本条件：1、1.指出被切割DNA分子的5′端和3′端; 目的基因；2、载体；3、工具酶；4、受体细胞。 2.如果将切割后的DNA同DNA聚合酶、4种dNTP在一起温育，这些 DNA末端会有什么样的变化？ 5’凹端被补平形成平末端而3’ 凸出端被切除成平末端 3.经过(2)中的反应后,还能用T4 DNA连接酶将Bam HI末端连接起来问答题 第一章 第二章 吗?Pst I末端呢?(T4 DNA连接酶能够连接平末端和粘性末端) 能 4.（3）中的连接后,能够重新形成Bam HI位点吗？Pst I位点呢？ 能 4、切口平移标记DNA前，用DNaseI处理DNA时应注意什么？ 2+2+答：应注意Mn离子不能存在和Mg的浓度及其处理时间、温度。 5、DNA聚合酶有哪些类型，各有什么活性？ 答：① E.coliDNApolI：5’-3’DNA聚合酶活性；5’-3’DNA外切 12.为了绘制长为3.0kb BamHI限制性片段的限制性图谱，分别用酶活性；3’-5’DNA外切酶活性。 ② E.coliDNApolI大片段（Klenow酶）：5′→3′DNA聚合酶活性；EcoRI、HpaII、EcoRI+ HpaII消化这一片段的3个样品。电泳图谱如下图所示。请根据这些结果绘制一个限制性图谱，要标明EcoRI3′→5′DNA外切酶活性；5’-3’DNA外切酶活性 。 和HpaII识别位点间的相对位置以及它们之间的距离（kb）。 ③ T4噬菌体DNApol：5′→3′DNA聚合酶活性（与Ｋlenow酶相似）； 3′→5′外切酶活性（Ｋlenow酶×200）：在无dNTP时只有该活性。 （常用于填平dsDNA的3′缩进末端及水解dsDNA的3′突出末端。） ④ T7噬菌体DNApol及测序酶：5′→3′DNA聚合酶活性; 3′→5′ 外切酶活性（Ｋlenow酶×1000）。 ⑤ 耐热DNA聚合酶（Taq酶）：在高温下仍具活性的DNA聚合酶。5′12、如何使用 Methylase（甲基化酶） 对克隆 DNA 进行保护？此步骤有什么意义？ →3′DNA聚合酶活性；5’-3’DNA外切酶活性 。 ⑥ 反转录酶（依赖于RNA的DNApol）：5’→3’DNA聚合酶活性(需答：在构建基因文库时，可用与接头中限制性内切核酸酶相应的甲基2+Mg）；RNaseH活性（5’→3’及3’→5’RNA外切核酸酶活性)； 化酶对克隆 DNA 先进行甲基化修饰，将插入片段上该酶可能的识⑦ 末端转移酶（terminaltransferase）（DNA修饰酶）：不依赖于模别序列先行保护起来。然后再插入片段末端加上接头，并经适量RE板的DNA聚合酶，在二价阳离子存在下，催化dNTP加在DNA分子的切割产生粘端分子，再提纯这些分子与去磷酸化的载体连接。意义：用这种方法，不仅保护了插入片段的大小不会改变，又有利于插入片3′-OH端。 段的回收，因为插入片段中特定限制性内切核酸酶的识别位点被保护6.在分子克隆中所用的酶主要作用于哪些底物？ 起来，重组后可以用特定的限制性内切核酸酶将插入片段回收。 73、某DNA序列中存在酶切位点，以此DNA为模板，在体外合成DNA序13、如何利用T4 DNA聚合酶进行双链DNA的3’ 末端标记？ 列，当用该酶进行酶切时，发现酶切不动，试分析可能原因？ 答：首先利用T4 DNA 聚合酶的3’ →5’外切核酸酶活性在缺乏dNTP①可能这种酶属于依赖于甲基化的限制系统，只识别经过甲基化的序的条件下切割dsDNA（双链DNA），产生5‘突出端，然后加入放射性列。该DNA序列中的酶切位点在体内是甲基化的，而体外合成的DNA标记的dNTP，利用T4 DNA聚合酶的5’ →3’合成酶的活性进行填序列没有经过甲基化酶的修饰，不能被该酶识别。 补合成，得到两端的3’端都是带标记的dsDNA。如果被标记的dsDNA②DNA不干净，杂质多（如多糖、蛋白质、酚类、有机溶剂等） 中有限制性内切酶的内切位点，则可以得到两段放射性标记的探针。 ③反应体系中存在酶的抑制剂 14、如何利用T4 DNA聚合酶制备平末端？ ④操作不当，酶或DNA加至管壁上，反应体系没完全混合 答：可利用T4 DNApol将任何形式的dsDNA转变成平末端的dsDNA。⑤反应条件不合适，用错了缓冲液或温度不合适 虽然Klenow酶能够进行这种反应，但是T4聚合酶有更好的选择，因⑥酶的活力不够。 为T4 DNApol的3’ →5’外切核酸酶比Klenow强得多，并且在高 浓度dNTP存在时，降解作用即会停止。根据这一特性，可以调整反 应条件，用T4 DNApol的外切酶活性将具有3‘端突出的dsDNA切平； 用其聚合酶活性将5’端突出的dsDNA补平。 切酶的识别序列，便于克隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。 66、T4 DNA 连接酶作用机制及提高平末端连接效率的方法。 答：T4 DNA 连接酶的作用机制：①ATP+DNA ligase(E)→ E-AMP+PPi。15. 用SalⅠ切割从噬菌体J2分离的DNA时，得到8个片段，分别②E-AMP 上的AMP 转移到DNA 的5′磷酸根上，使其活化，释放出酶。是：1.3、2.8、3.6、5.3、7.4、7.6、8.1和11.4kb。但是，用Sal③活化的5′磷酸根与相邻的3′羟基形成3′，5′- 磷酸二酯键，并Ⅰ切割从被感染的寄主细胞中分离到的J2噬菌体DNA时，只得到7释放出AMP。 个片段，分别是：1.3、2.8、7.4、7.6、8.1、8.9和11.4kb。根据提高平头末端连接效率的方法包括：①加大连接酶用量（10 倍大于这些结果，你得到哪些信息？ 粘性末端的连接）。（1 分） 答：(1)J2噬菌体是一种双链线性的DNA分子；(2)基因组全长是②加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会。（1 分）③加入47．5kb；(3)进入宿主后成环状；(4)5．3和3．6kb的片段分别位10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用。（1 分）④加入单价阳离于线性DNA的两端。 子（NaCl），最终浓度150-200 mmol/L。（1 分）。 16.以置换型λ噬菌体作为载体进行克隆时，为什么说能够形成噬菌 斑的就一定是重组体？ 72、什么是限制性内切核酸酶的星号活性?受哪些因素影响? 答：改造的置换型噬菌体载体，重组人外源片段之后，总体积不能超答:Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异过λ基因组的105％，不能少于λ基因组的75％。以置换型λ噬菌体性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件DNA作为载体，首先要分离左、右两臂同外源DNA重组。如果没有外的改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变，源片段，仅是两臂连接，长度短于λ基因组的75％，不能被包入噬改变后的活性通常称第二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活菌体颗粒，就不能感染寄主，也就不能形成噬菌斑。如果插入了外源性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星活性。概括片段后，总长度超过丸基因组105％后，也不能包入噬菌体颗粒，自起来，诱发星活性的因素有如下几种：(1)高甘油含量＞5％，（v／然不能形成噬菌斑。 v)；(2)限制性内切核酸酶用量过高(>100U／μg DNA)；(3)低离子强17.如何以细菌（或者大肠杆菌E.coli）质粒DNA为载体克隆一个编度(<25 mmol／L)；(4)高pH(8.0 以上)；(5)含有有机溶剂，如DMSO，码大鼠生长激素的基因，并转化到细菌（或者大肠杆菌E.coli）中2+2+2+2+2+乙醇等；(6)有非Mg的二价阳离子存在(如Mn，Cu，C0，Zn等)。 进行表达。分析一下在实验中可能遇到哪些问题及可能的解决办法？ 答：（一）要使动物中编码激素的基因在大肠杆菌中表达，通常遇到57、当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，的问题有： 应采取什么措施？为什么？答：注意星活性，先低盐，后高盐；先低(1)细菌的RNA聚合酶不能识别真核生物的启动子。（解决办法：在温酶，后高温酶；并且可以直接在换酶前将第一种酶失活，再加第二cDNA前加上细菌的启动子。） 种酶，否则，易产生星活性。或使用通用缓冲液。 (2)大多数真核基因有内含子，这些内含子在转录后从前体mRNA中被 切除而形成成熟mRNA。细菌细胞没有这样的机制来去除内含子。（以68、简述影响Ⅱ型限制性核酸内切酶活性的因素有哪些？ 激素基因的mRNA为模板反转录成cDNA。） 答：①DNA 样品的纯度：DNA 样中混有蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、(3)有些真核生物的蛋白质是通过前体分工加工而来的，例如胰岛素EDTA、SDS、NaCl等,都有可能抑制酶活性。可采用以下方法，提高酶就是通过加工去除前体分子内部的33个氨基酸残基而来，剩下的两活性：加大酶的用量，1μg DNA 用10U 酶、加大反应总体积、延长段肽链分别形成胰岛素的a、b链。（有时可以在离题的条件下进行蛋反应时间.②DNA 样品的甲基化程度：采用去甲基化酶的大肠杆菌菌白质加工过程。） 株来制备质粒DNA，可防止DNA的甲基化。③ 酶切反应的温度：多数(4)产生的真核生物的蛋白质产物可以被细菌的蛋白酶所识别和降标准反应温度是37℃，如SmaI 为25℃或30℃ ，SfiI 为50℃ 。反应解。（选用合适的突变型宿主。） 温度过度或过低都会影响酶活性，甚至导致酶失活。④DNA 分子结构：（二）针对上述可能出现的问题，建议在克隆的过程中采取以下措施：某些酶切割超螺旋质粒DNA 时，酶量比切割线性DNA 时高出多位，可①应将激素的编码序列置于含有核糖体结合位点和起始密码子ATG高达20 倍。⑤核酸内切酶的缓冲液：高浓度的酶、高浓度的甘油、的细菌强启动子的附近 低离子强度、极端pH 值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列②可以以激素的mRNA为模板用反转录酶合成激素的基因。这种DNA发生低特异性，即所谓的“星活性”现象。 不含内含子可插入到载体中进行克隆。此外，如果蛋白质序列短则可71、什么是细菌的限制—修饰系统?有什么意义? 通过化学合成得到该基因。合成的基因应含起始密码ATG、通过该激答：细菌中有作用于同一DNA 的两种酶，即分解DNA 的限制酶和改变素蛋白的氨基酸序列推测而来的编码序列，以及1—2个终止密码：DNA 碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶。而且，这两种酶作用于ATG——编码序列——TGATAG。现在，这个合成基因可被插入载体中。同一DNA 的相同部位，把这两种酶所组成的系统称为限制与修饰系③有时加工过程可以在离体条件下进行。如果加工有困难，可以用合统。 成基因，从而免除加工过程。 不同种的细菌或不同的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组④选用合适的突变型宿主从而防止蛋白酶水解。如果用酵母作为宿主成的限制与修饰系统。修饰的本质是通过甲基化酶将DNA 中某些碱基上述许多问题都可以较容易地解决，尤其是现在有既能在大肠杆菌中进行甲基化修饰，由于宿主自身DNA 上的这些位点进行了修饰，限制又能在酵母中复制的穿梭质粒载体。 酶就不能进行切割。由于外来的DNA 在相应的碱基上没有被甲基化， 宿主的限制酶通过对该位点的识别来分辨敌我，并将人侵的外来DNA 18.以E.coli为例，表达载体比克隆载体多了哪些功能原件，各有分子降解掉。所以DNA 限制作用和修饰作用为细胞提供了保护。 什么生物学功能？ 第三章