第4章 提取的基本理论 2005.06

盐、雷氏盐等。用过滤法分离沉淀，再使用适当的方法对沉淀进行复分解而得到原来的酸性或碱性化合物。

7液相层析法

液相层析（LC）分离纯化法包括制备薄层层析（PTLC）、离心薄层层析和柱层析（CC）等。层析用分离介质有硅胶、氧化铝、硅藻土、纤维素、聚酰胺、葡聚糖凝胶、活性炭等，有正相层析和反相层析之分。柱层析可按压力大小分为常压柱层析、低压柱层析、中压柱层析和高压柱层析。 8重结晶

固体天然化合物达到一定的纯度，可呈结晶状，用过滤法可以使结晶和母液分开，达到进一步分离纯化的目的。常用混合溶剂法进行重结晶操作，即将粗晶溶于少量第一溶剂（使结晶易溶解的溶剂）中，然后加入恰好使溶液变成轻微混浊状所需要的第二溶剂，静置析晶，过滤收集晶体。若结晶的纯度还不够，可进行第二次重结晶或反复重结晶，以得到高纯度的天然化合物结晶。

九、 天然动物药物的制备

1．天然动物药物概述

天然动物药物与天然植物药物和化学合成药物一样，也是人类防病、治病的重要药源，在人类历史上占有举足轻重的地位。最初，天然动物药物大多数来自动物脏器，俗称脏器药物。其原料来源主要是家畜、家禽的组织、器官、血液和毛发等；如：①从动物大脑可制备脑磷脂、卵磷脂、胆固醇、褪黑激素和催眠多肽等；②从动物心脏可提取细胞色素C、心脏激素、辅酶Q10、辅酶A和辅酶I等；③从动物肝脏可分离过氧化氢酶、肝解毒素和超氧化物歧化酶等；④从动物胃肠及粘膜可制备胃蛋白酶、胃肠道激素、凝乳酶和肝素等；⑤从动物骨可提取蛋白胨、硫酸软骨素；⑥从动物毛发可生产各种氨基酸；⑦从动物血液可制备水解蛋白、纤溶酶、凝血酶、血红素、超氧化物歧化酶等；⑧从动物胆汁可获得人工牛黄及其各种制剂、胆酸系列衍生物等；⑨从人尿可制备尿激酶、绒毛膜激素、抑胃素等。现在，由于制药科学的发展，天然动物药物的原料来源已不仅仅局限于动物脏器，但脏器来源的药物在目前的临床用药中仍占重要的地位和相当的比例。

中国早在公元6世纪就开始使用羚羊角治中风、用胎盘作强壮剂、用鸡内金止遗尿和消食健胃。20世纪20至80年代是天然动物药物的鼎盛时期，在这一时期，由于人类对动物脏器的有效成分的逐步明确及其防病、治病机理的了解，促进了天然动物药物的发展。20

世纪90年代以后，由于现代生物技术，尤其是微生物发酵技术和基因工程技术的迅速发展，某些天然动物药物，如：药用的蛋白质、酶和氨基酸等产品，从原有的以动物组织或器官为主要来源通过分离、提取制备，转为微生物发酵产品或基因工程产品。

由于从脏器中提取天然动物药物的成本高、产量低和存在免疫抗原性等问题，已经远远无法满足日益增长的临床需要。因此，近二十年来，大规模动物细胞培养技术和转基因家畜乳腺生物反应器技术逐渐成为某些动物药物的新兴制备技术，采用这些高新技术，不但能获得天然来源难以得到的内源生物活性物质，达到某些动物药物的批量生产，解决提取原料的不足和免疫抗原性的局限性，而且能通过构效关系研究开发出新的生物活性物质，提高其药用价值，扩大动物药物的来源。现在，某些活性蛋白，如：乳铁蛋白、α-抗胰蛋白酶、纤溶酶原活性因子、活性蛋白C、血纤蛋白、组织纤维蛋白溶酶原激活剂、人血清白蛋白和促红细胞生成素等，已能成功地在转基因牛、羊或猪等哺乳类动物乳腺中进行表达，然后从乳液中进行分离制备。

按照药物的化学本质和结构进行分类，天然动物药物可划分为以下几大类：① 氨基酸类药物：包括天然氨基酸及其衍生物。② 活性多肽类药物：主要有天然多肽类激素和人工合成活性多肽。③ 蛋白质类药物：包括蛋白质激素、天然蛋白质、蛋白质类制品、结合蛋白质、粘性糖蛋白、血浆糖蛋白及其它糖蛋白等。④ 酶类药物：包括消化酶、抗炎酶、循环酶、抗癌酶等水解酶。⑤ 核酸类药物：主要包括核酸碱基及其衍生物、腺苷及其衍生物、核苷酸及其衍生物和多核苷酸等。⑥ 糖类药物：主要包括单糖、低聚糖、多糖和糖的衍生物。⑦ 脂类药物：主要包括不饱和脂肪酸、磷脂、前列腺素以及胆酸类等。

天然动物药物的制备方法主要有：提取法、发酵法、化学合成法、组织培养法和基因工程技术法等。其中前三种是现阶段最常用的方法，而提取法则是最基本的，因为不管哪一种方法都包含着提取的工艺过程。

提取法指用溶剂从动物组织或器官中提取天然有效成分的工艺过程。常用溶剂有水、稀盐、稀酸、稀碱和有机溶剂等。

发酵法是从微生物发酵液中获取代谢产物或其它有关生化产品的过程，包括菌种培养、发酵、提取、纯化等步骤，详见第二章的内容。

化学合成法是根据已知的药物化学结构，采用有机化学合成的原理和方法，制备生化药物的工艺过程。适合于小分子生化药物的制备。

2．多肽类药物

多肽类药物常指多肽类激素和活性多肽，是细胞中具有调节生理和代谢功能的微量有机

物，是由2-50个氨基酸残基组成的低分子量化合物，多数无空间构象，在生物体内浓度很低，血液中仅为10

－10

～10

－12

mol/L，但在调节生理功能方面起着非常重要的作用。

多肽类药物的分子较大，不能直接进入靶细胞中，而是先与分布在细胞表面的特异性受体结合，在激活了与受体相连接的效应器后，进一步激活了细胞内的一些酶系，影响了蛋白质的合成，导致特定的生理效应或发挥某种药理作用。

自1953年人工合成了第一个有生物活性的多肽催产素后，20世纪50年代，多肽类药物的研究主要集中在脑垂体分泌的各种多肽激素方面，60年代，研究重点开始转移到下丘脑神经细胞所分泌的活性肽，70年代以后，脑啡肽及阿片样肽等神经肽的研究进入高潮，近年来，由于发现肠胃激素（即脑-肠肽）具有既存在于胃肠道粘膜内，又能存在于神经系统中的双重分布现象，对其研究开始活跃，在分泌调节机理、活性肽药物剂型的研发、多肽的结构与功能构效关系等方面，均取得了很多进展。

根据作用和分泌的部位，多肽类药物可分为：加压素及其衍生物、催产素及其衍生物、促皮质素及其衍生物、下丘脑-垂体肽激素、消化道激素、血管紧张肽、其它激素和活性肽等（表4-1）。

表1 多肽类药物的分类

分 类 加压素 （抗利尿激素）

催产素

品 种

加压素、脑神经垂体素、鞣酸加压素，鸟加压素等 催产素，去氨催产素等

用 途

具利尿和升高血压的作用，用于尿崩症的治疗

促进子宫及乳腺平滑肌收缩，用于分娩催生及减少产后出血

促皮质素

锌促皮质素、明胶促皮质素、促皮用于肾上腺皮质功能实验，治疗质多肽等

促甲状腺素释放激素、促乳素释放激素、生长激素释放激素等 胰泌素、胃泌素、抑胃肽、胃动肽等

血管紧张肽Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等 降钙素、脑啡肽、睡眠肽、记忆肽等

哮喘、癫痫、重症肌无力 控制全身的内分泌

下丘脑－垂体肽激素

消化道激素 血管紧张肽 其他活性肽

促进或抑制胃液分泌 急性低血压或休克抢救

天然多肽类药物，除了有些是蛋白质的降解产物外，大多数是由下丘脑、垂体和胃肠道等产生的多种具有特殊生理作用的激素，可从内分泌腺体、组织器官、分泌细胞和体液中提取获得。多肽类药物的化学性质与氨基酸和蛋白质相似，可以充分利用其两性性质、胶体性质、变性特点和电离性质等进行制备，主要的制备方法有提取法、化学合成法和基因工程技

术法等三种。

1．提取法多从天然生物材料中经分离和纯化等工艺制备多肽类药物，主要步骤有：选择适宜的生物细胞、组织和器官为原料，经过细胞破碎后用适宜的溶剂进行提取；然后利用多肽的溶解度、分子形状、分子量大小、电离性质和生物功能专一性等理化性质的差异进行纯化。

2．化学法合成法多采用N,N-二环已基羰酰亚胺（DCCI）为缩合剂，与氨基酸或小肽作用，脱水缩合生成多肽，沉淀副产品N,N-二环已脲（DCU）后，再分离出合成多肽。

3．基因工程技术法是利用基因工程技术对蛋白质进行化学修饰，合成及人工定向设计或者把特定基因转入宿主细胞进行表达多肽类药物。

1） 降钙素

降钙素是1961年发现的第二个调节钙浓度的多肽激素，能与甲状腺素共同维持血钙平衡状态。临床上可用于骨质疏松症、癌症伴随骨转移、甲状腺功能亢进和成人高血钙症等。

降钙素是由32个氨基酸残基组成的单链多肽，N-末端的半胱氨酸与7位上的半胱氨酸间形成一个二硫键，C-末端为脯氨酰胺，其生物活性与此关系密切，若去掉脯氨酰胺，则生物活性尽失。

自然界中降钙素广泛存在于多种动物体内，由甲状腺内C细胞分泌产生，其提取原料主要有猪甲状腺和鲑鱼、鳗鱼的鳃体。各种不同动物来源的降钙素，氨基酸排列顺序和生物活性有些差异，从鲑鱼中获得的降钙素对人的降钙作用比从其它哺乳动物中分离出的降钙素高20～50倍。

猪降钙素为白色或类白色粉末，效价约为50～200 MRC U/mg。可溶于水和碱性溶液中，不溶于乙醇、丙酮、苯和氯仿等有机溶剂，难溶于有机酸。粉末25℃以下避光可稳定保存2年，水溶液4℃保存可稳定7～10天，蛋白酶和氧化酶可破坏其活力。

虽然目前已经成功地采用化学合成方法或基因工程技术制备降钙素，但我国仍常用猪甲状腺为原料，采用提取法制备猪降钙素，其工艺过程包括：酸性水溶液提取、有机溶剂沉淀制备粗提物、等电点沉淀去除杂蛋白、层析纯化降钙素、干燥成粉（图4-1）。

猪甲状腺丙酮粉 （提取） 0.1 mol/L盐酸，60℃，1 h 提取液 （沉淀） 异戊醇：醋酸：水=20：32：48 50℃，2h，硅藻土助滤 解析液 沉淀物 （除杂蛋白） 3mol/L氯化钠溶解， 调pH2.5，静置 （冷冻干燥）

上清液 （层析纯化） 羧甲基纤维素动态吸附，pH4.5，0.02mol/L 醋酸钠缓冲液动态吸附 猪降钙素粉末

图4-1 猪降钙素的制备工艺