第七章 亲和层析技术

体积。亲和色谱中，固定配基在蛋白和凝胶之间产生的额外亲和作用[1]。

VE?V0?KdVi （式2-5）

''而

Kd?'??E?LM????E1? （式2-6）

?E?因为

Kd?Kd'??E1?LM???Kd （式2-7）

?E1?

Kd??E1? （式2-8） ?E??LM?Klm将（3）（4）（5）（7）和（8）合并，则得到

VE?VE??VE?V0?' （式2-9）

由于蛋白质与配基的相互作用而增加的洗脱体积与结合配基浓度（[LM]）成正比，而与蛋白和配基作用的解离常数Klm成反比，如果介质未被配代，[LM]=0，则VE′=V0,这时凝胶过滤起主要作用。

假设VE＞＞V0，则可得到：

?VE'??LM?????1（式2-10） ?V?Klm?E?实际上，VE′/VE很难测定，但在洗脱液中，加入可活性配基或竞争性抑制剂，使固定

配基的表边的亲和力降低。其数值可以测得。这一过程可以表示如下：

dlmE???E1?LM????E1?LM

KK1E?I???EI

KiE1?I1???E1I1

kKI??E??I? ?EI?ki??E1??I1?（式2-11）

?E1I1??LM?KlmK1ki??I?[EI]和[E1I1]分别是填料外部和内部的蛋白-抑制剂复合物。如此，可得到类似的方程：

VE?VE?(VE?V0)'（式2-12）

?VE'??VE?V0????V?1???VE?E????LM?K1? （式2-13） ?K??k?Ilmi?在可溶性亲和竞争性配基的存在下，固定配基对蛋白的阻滞作用降低，其程度取决于可

溶性配基和固定配基的相对浓度和解离常数。

2.2亲和介质的制备

亲和层析介质是将亲和配基通过化学键接在层析介质上而得到的。常用层析介质并不能直接和亲和配基化学结合，一般先要进行活化或功能化，即要引入反应基团。活化后的层析介质能够通过反应基团和亲和配基反应，从而制备出亲和层析介质。因而亲和层析的制备至少应包括以下几步：

(1)介质和配基选择 (2)介质的活化或功能化

(3)活化的介质和亲和配基的偶联，偶联后未发生偶联反应的反应基团必须封闭或钝化。

(4)洗涤除去未反应的配基和其他反应物。

2.2.1介质的选择

介质是亲和配基附着的基础，起着支撑和骨架作用。通常而言，亲和色谱的介质应具备下面四个条件 ：(1)具有多孔网络结构；(2)非特异吸附小且化学性质呈惰性，表面电荷尽可能低；(3)理化性质稳定，不因共价偶联反应的条件及吸附条件的变化而发生变化；(4)基质必须能够活化或功能化。

在亲和色谱发展的早期，多采用天然材料的多糖类球形软胶，随着技术的发展和分离要求的提高，一些可以在高流速下使用的半硬或硬质的细颗粒球形填料也在亲和色谱中得到应用，常见的亲和色谱介质有如下几种：

（1）多糖类：主要由纤维素（cellulose）、葡聚糖（dextrin）和琼脂糖（agarose）等制备而成的基质。纤维素基质比较软，容易压缩，但价格低廉，目前已在大规模的亲和层析中应用。

交联葡聚糖（又称Sephadex）本身孔径较小，经过活化功能后，会进一步降低其多孔性，使其亲和活化效率降低。琼脂糖(agarose)是亲和层析的理想介质之一，具有优良的多孔性，而且经过交联后，可大大改善其物理化学稳定性和机械性能。 （2）聚丙烯酰胺

聚丙烯酰胺凝胶也是一种常用的亲和层析介质。它是由丙烯酰胺与双功能交联剂N，N’－亚甲基双丙烯酰胺在一定条件下共聚产生的凝胶。通过调节单体浓度和交联剂的比例，可得到不同孔径的凝胶。聚丙烯酰胺凝胶的非特异性吸附较强，一般应在较高离子强度（0.02M以上）下操作，以消除非特异的离子交换吸附。其优点是功能基团多。聚丙烯酰胺和琼脂糖共聚物Ultrogel凝胶（LKB产品）非特异性吸附少，容易改性。

（3）无机基质

亲和层析可以使用的无机基质主要有可控制孔径多孔玻璃（CPG）、陶瓷和硅胶等。无机基质有其本身的优点，它具有优良的机械性能，不受洗脱液、压力、流速、PH和离子强度的影响，可获得快速、高效的分离；而且可抗微生物腐蚀，容易进行消毒。但是也有缺点，如表面对某些蛋白质有非特异性吸附作用，而且难于功能化等。亲和层析中所使用的可控孔径多孔玻璃是粒径较大的玻璃珠（40－80目或80－120目），因为对于亲和层析而言，孔径的选择是一个关键，它决定了功能化基团的数量和亲和介质的吸附容量。如孔径为2500A的玻璃珠，其吸附容量显著小于孔径为1750和750A的玻璃珠。为利用无机基质的优点（如机械强度高），而避免其缺点（如不易于功能化），目前很多基质采用涂层，即将容易功能化的介质如多糖包裹在多孔无机基质上，从而易于接上多种亲和配基。

专一性、容量及稳定性是衡量所选介质好坏的三个标准。在用于分析时，专一性比容量及稳定性重要，而应用制备时，吸附剂的稳定性是最主要的指标，同时还要考虑成本因素。对于不同的介质而言，这些要求不可能同时满足。所以在介质的选取时，应该根据具体的分离要求选择合适的介质。

2.2.2介质的活化和偶联

用于活化惰性层析介质的化学反应主要由介质和本身的性质和稳定性决定。对于制备亲和介质而言，亲和配基和层析介质的化学反应过程应相对比较温和，尽可能保持配基和介质原来的性质，以便保持目标产物和亲和介质之间特异性或专一性的作用。现将几种常用的活化方法比较，如表2-5：

表2-5 各种活化方法比较

活化剂 戊二醛 溴化氰 双环氧化物 二乙烯基砜 羰基二咪唑 高碘酸盐 三嗪 重氮化物 肼 试剂毒性 中等 高 中等 高 中等 无毒 高 中等 高 活化时间(h) 1-8 0.2-0.4 5-18 0.5-2.0 0.2-0.4 14-20 0.5-2.0 1-3 偶联时间(h) 6-16 2-4, 14-48, 快 6天左右 12 4-16 0.5-1.0 3-16 偶联pH 6.5-8.5 8-10 8.5-12 8-10 8-9.5 7.5-9.0 7.5-9.0 6-8 7-9 稳定性 好 PH<5或PH>7 不稳定 高PH不稳定 PH>10稳定 好 好 中等 较好 非特异性吸附 芳香物

(1)多糖基质 以下几种方法为常用的多糖基质活化和偶联方法。

溴化氰法(CNBr)

溴化氰法是活化多糖基质的介质中最为常用的方法，由Axen和Porath等人1967年提出，其反应时间短，只需要几分钟至几十分钟。但是溴化氰是剧毒药品，活化操作必须在通风橱中进行。反应机理示意图如图2-2所示。

图2-2溴化氰活化偶联法

以琼脂糖的活化偶联过程为例，说明溴化氰法活化偶联过程，具体如下：

①在装有20ml水，2M NaHCO3烧杯中加入20克充分洗涤的湿琼脂糖，放在冰(-15℃)浴中4－5℃分钟。②用磁力搅拌器，徐徐搅拌悬浮物，加入溴化氰（用量为100mg/g湿胶），在4－5℃下活化10分钟。因为溴化氰不溶于水，所以最好先将溴化氰溶于乙晴中，并于－20℃下贮存。③活化一结束，立即将凝胶转移到玻璃布什漏斗中，迅速过滤，在漏斗下的烧瓶中装有固体硫酸亚铁，过滤下来滤液中所含的溴化氰能和固体硫酸亚铁迅速反应，生成无毒的亚铁氰化物。用1L冷的蒸馏水及1L偶联用的缓冲液依次洗涤凝胶，得到的活化胶。④偶联，将要偶联的配基溶解在0.1M NaHCO3（PH8.3），0.5M NaCl或其它缓冲液（如硼酸、

磷酸盐，但离子强度须降低到8-10mM），亲和配基的加入量取决于需要的配基密度，低分子亲和配基浓度为1-10m mol/ml，蛋白质亲和配基浓度5-10mg/ml。加入配基后，在室温下(22-25℃)搅拌2小时或在4℃下过夜。偶联完成后，残留的活化基团可用氨基葡萄糖、乙醇胺中和。 三嗪法 均二氯三嗪或三氯三嗪（氰尿酰氯）可活化多羟基的介质。单氯三嗪基—多糖复合物，在PH7-9及0-20℃条件下，可和含有伯胺之类亲和配基偶联，生成亲和层析介质。过程如图2-3所示

其中R’为亲和配基

图2-3三嗪法活化偶联原理图

具体操作过程如下：

①活化：100ml凝胶用无离子水洗涤后，在室温下搅拌30－45分钟。加入二氯三嗪溶液（0.5~1.0g二氯三嗪溶于15－20ml丙酮，并用冰水稀释1倍，此操作需在通风柜中，因为二氯三嗪有毒）。二氯三嗪溶液加入5分钟后，再加入2M NaHCO3溶液，继续搅拌5分钟，混合液过滤并用0.1M磷酸缓冲液（pH6）及含有50％丙酮洗涤，得到活化凝胶。②偶联：经洗涤的凝胶用0.5M硼酸缓冲液（pH8.7）或其它无氨基缓冲液（pH在7.5-9.0之间）悬浮，加入配基，配基的加入量为：小分子配基0.5-1mg/ml凝胶，大分子配基5-10mg/ml凝胶，在4℃或在室温下，搅拌反应4－12h，用相同的缓冲液洗涤，除去过量的配基。用乙醇胺封闭未偶联的活化基团。

高碘酸盐法

偏高碘酸钠(NaIO4)可将多糖基质上相邻的连二醇基氧化成为醛基，而且偏高碘酸钠可溶于含水溶液中，反应后易于用水洗去残留的偏高碘酸钠，其反应式如下（图2-4）：

其中R为亲和配基

图2-4偏高碘酸盐活化反应示意图

高碘酸盐法适用于琼脂糖、纤维素和交联葡聚糖介质的活化，是一种简单、快速的活化方法，其中纤维素偶联取代程度高，而对孔隙率较高的Sephadex凝胶(G-100,G-200)，经高碘法处理后易于碎裂，因此不应采用。

高碘酸法结合的配基没有溴化氰法高，但其操作简单、安全。配基密度一般可达0.05-1.0 mmol/ml凝胶。

环氧化物法

环氧化物法包括单环氧化物活化法和双环氧化物活化法。这两种活化方法有采用不同的试剂，如单环氧化物活化法常用氯代环氧丙烷做活化剂，双环氧化物活化法常用二羟基正丁